菌种保藏方法

1、菌种保存方法常用有以下方法：1半固体保存法：将菌落穿刺接种在半固体中，4度存放，一般可以管3 6月2低温冻存法：接种菌落的肉汤加20%灭菌甘油，置一20或一70度，可存放一年以上。3真空冻干法：试最理想的保存方法，但需要特殊仪器基因工程菌：1： 30%的灭菌甘油与培养好的菌悬液按照1： 1的比例混合，分装到1.5ML的离心管中， 每关1ML，存于-20度，但仅保存半年就不太好了，最好保存到一一70度的低温冰箱中。 也可用10%的灭菌甘油从斜面上洗下保存。2：菌悬液中加甘露醇和人血白蛋白目前菌种的保存方法主要有以下几种:1.传代培养保存法:一般来说，这是最基本的保存法,用 斜面，穿刺或其他方法培

2、养的传代菌种，一般要保存在5度，但因类而异，如霍乱，淋球，脑膜炎, 厌氧菌，钩体等要保存于37度为宜.2.液体石蜡覆盖保存法:这是传代培养的变相方法,可以适 当地延长保存时间，主要适用于霉菌,酵母菌，放线菌,需氧性细菌等的保存.3 .载体保存法/1) 土壤保存法:主要用于形成抱子回抱囊的微生物的保存，特别适用于真菌和放线菌不改变性状 的长期保存.(2)砂土保存法:常用于梭状芽抱杆菌和一部分霉菌的保存，可保存数年.(3)硅胶 保存法:本法对保存链抱霉菌较有效，对酵母菌的保存也较有效(4)磁珠保存法:用本法保存根 瘤菌在室温下至少可保存2年半(5)滤纸保存法:适用于对干燥抵抗力较强的微生物，如油芽

3、 抱细菌和葡萄球菌.另外噬菌体，放线菌和丝状菌也可用本法.4.悬液保存法哆1)蒸溜水保存 法:霉菌，酵母菌和放线菌的大部分，使其悬浮于蒸馏水中，可在室温下保存数年,青枯病假单抱 杆菌也可用本法.(2)糖液保存法:过去用于保存酵母菌，但现在已不常用.(3)其他悬液保存法: 如乳链球菌可用PBS保存，放线菌可用0.125%稀琼脂液保存.5.寄主保存法:一些微生物如一 部分病毒，立克次氏体，螺旋体.原虫和少量丝状菌目前只能使活着的动物，昆虫，植物体和寄生 微生物等感染并传代，否则不能保存.6.冷冻保存法噎1)低温冰箱保存法:多说微生物在-20度 保存效果良好,(2)干冰保存法:-70度保存,(3)液

4、氮保存法:保存温度克达到-196度，本法可说 是使用范围最广的微生物保存法.7.冷冻干燥保存法:使微生物在冷冻状态下，在减压下利用升 华现象除去水份，使细胞的生理活动事实上停止，从而长期维持生活状态，本法适用于大多数 细菌和放线菌，另外病毒,噬菌体，立克次氏体，霉菌和酵母菌再多数情况下用本法保存.8.冷冻 干燥以外的干燥保存法唆1)常压干燥保存法,(2)菌片封袋干燥保存法，(3)Stamp干燥保存 法,(4)Sordelli干燥保存法,(5)1-干燥保存法(真空干燥保存法)我们实验室保存菌种的方法是：1将菌落穿刺接种在半固体中，如加有琼脂的肉汤培养基，4度存放，保存时间较短一般3 4月2接种菌

5、落的肉汤0.9ml加100%灭菌甘油0.1ml，置一20度冰箱中可以保存一年左右，一 70度冰箱或液氮中可放置N年，细胞的保存我们放了近十年，仍然复苏的很好 3基因工程菌的保存：1：为防止基因工程菌质粒丢失或不稳定，保存菌种加入甘油的量应该不大于10%，一般 0.9ml的菌液加0.1ml80%高压灭菌甘油一70度冰箱保存菌种的保藏：菌种是一个国家所拥有的重要生物资源，菌种保藏(preservation)是一项重要的微生 物学基础工作。菌种保藏机构的任务是在广泛收集实验室和生产菌种、菌株(包括病毒株甚 至动、植物细胞株和质粒等)的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱以及 便于研究、交

6、换和使用的目的。为此，在国际上一些工业较发达的国家中都设有相应的菌种 保藏机构。例如：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)，美国典型菌种保藏中心(ATCC)， 美国的“北部地区研究实验室”（NRRL），荷兰的霉菌中心保藏所（CBS），英国的国家典型 菌种保藏所（NCTC），苏联的全苏微生物保藏所（UCM）以及日本的大阪发酵研究所（IFO） 等都是有关国家有代表性的菌种保藏机构。菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异。首先要挑选典型菌种（typeculture）的优 良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生抱子、芽抱等）；其次，还要创造一个适合其长期 休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺

7、乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中占有 首要地位就不言而喻了。五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂，当然，高度真空 还可同时达到驱氧和深度干燥的双重目的。除水分外，低温乃是保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度低限约在-30 r，可是， 在水溶液中能进行酶促反应的温度低限则在-140C左右。这或许就是为什么在有水分的条件 下，即使把微生物保藏在较低的温度下，还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。在低 温保藏中，细胞体积较大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者 敏感。其原因同低温会使细胞内的水

8、分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤有 关。如果放到低温（不是一般冰箱）下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，可因产生的冰晶 小而可减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可 减少对细胞的损伤。当然，不同微生物的最适冷冻速度和升温速度也是不同的。例如，酵母 的冷冻速度以每分钟10C为宜，而红细胞则相应地为2000C。冷冻时的介质对细胞损伤与 否也有显著的影响。例如，0.5mol/L左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈 的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清白蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯毗咯烷酮（PVP） 虽不能透入细胞，但可能是通过与细胞表面结合

9、的方式而防止细胞膜受冻伤。在实践中，发 现用较低的温度进行保藏时效果更为理想，如液氮温度（-195C）比干冰温度（-70C）好， -70 C又比-20 C好，而-20 C则比4 C好。一种良好的保藏方法，首先应能保持原菌的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性 和操作的简便性。具体的菌种保藏方法很多，其原理和应用范围各有侧重，优缺点也有所差 别，现将其归纳如下：*凡采用休眠态的微生物保藏时，不管用其中的何种方法，均可作常温保藏，也可用低 温保藏（如12, 4, 0，-2-75, -196C等）。一般温度越低则保藏效果越好。如果同时采用 避光保存，则效果更佳。*在湿法保藏中，如采用覆盖一层无菌石

10、蜡油，或试管口用橡皮塞密封等方法来隔绝氧 气，则效果更好。*下划横线的方法，为最常用的保藏法。以上介绍的各种保藏法的有关技术细节可参阅专门参考书。现将实验室中最常用的五种 菌种保藏法的比较列于表8-13中。在我国，菌种保藏一般用三种方法进行：固体培养基斜面上定期移植法（5C下保藏）； 石蜡油封藏法（室温下保藏）；冷冻干燥保藏法（10C下保藏）。此外，对放线菌还另加砂 土法保藏，对丝状真菌则另加麦麸皮法保藏等。在国际著名的美国ATCC （AmericanTypeCultureCollection）中，目前已改为仅采用两种 最有效的方法，即保藏期一般达515年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达20年以上的液 氮保藏法，以达到最大限度地减少传代次数和避免菌种衰退的目的（见图840）。图839中所表示的保藏原理