荧光原位杂交技术原理及操作步骤

1、荧光原位杂交技术原理及操作步骤1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合 应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧 光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷 贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得 了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于 绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展 和广泛应用。原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是 一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测 的染色体或DNA纤维切片上

2、的靶DNA与所用的核酸探针是同源互 补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂 交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素.地高 辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化 学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性.定量或相对 定位分析。实验流程FISH样本的制备一探针的制备一探针标记一杂交 一染色体显带一荧光显微镜检测一结果分析。特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非 放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的 要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺 点是探针不稳定.自显影时间长.放射线的散射使得空

3、间分辨率不 高.及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不 足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以 下优点：荧光试剂和探针经济.安全；探针稳定，一次标记后可在两年内使用；实验周期短.能迅速得到结果.特异性好.定位准确；FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探 针相当；多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多 种序列；既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可 以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时 效率明显下降。应用该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，

4、而 且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因 定性.定量.整合.表达等方面的研究中颇具优势。荧光原位杂交FISH操作规程一.主要试剂1变性液20SSC4mlddH2O8ml甲酰胺28ml2PBD液 1000ml20SSC 中加入1.25gTween20二.操作流程1硅化玻片切片烤片60过夜2脱蜡入水斜置切 片空干32SSC洗涤三次每次5min下简写为354 0.2M HCl处理室 温10接步骤35 0.25mg/ml蛋白酶K处理室温1530接步骤36切 片入20梯度酒精脱水各2空干7切片入85变性液88迅速入20 梯度酒精脱水各2空干9杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加 盖玻片37过夜10反应体系中加入等体积的甲酰胺4510112SSC洗 涤405min2SSC洗涤375min12 PBD洗涤切片3213滴加异硫氢酸荧 光素标记的亲和素AvidinFITC,塑膜封片3730min14洗涤同步骤 1215 滴加抗