脂肪酶酶解奶油制备天然香原料

1、脂肪酶酶解奶油制备天然香原料香精香料被广泛用于食品添加剂、化妆品、饲料等方面，其需求量也逐年 呈大幅度增加趋势。根据BBC Research公司发布的全球香精香料市场报告预测， 2011年将达78亿美元。世界各国所用的香精香料也有差距,美国的食用香料种类 约为2000余种，欧盟的食用香料大约有3000余种，中国批准使用的食用香料大约 有1500多种。随着人们生活质量的提高，消费者要求天然香料的愿望日益增加， 并希望获得品质和性能更好的香料产品。奶味香精是食品工业中应用最广泛的香精之一，酶解乳脂是食品工业中重 要的一种原料，目前应用广泛且具有很大的应用潜力，如作为添加剂应用于焙烤 食品（面包、蛋

2、糕、曲奇等）、谷物食品（薄饼）、糖果（巧克力产品、太妃糖）、乳 制品（咖啡伴侣、糖霜、干酪、黄油）以及其他一些产品（调味品和点心）、乳制品 （发酵酸奶、调味奶）等。1天然香料根据美国联邦法典规定，天然香料指“来源于天然物质的芳香油类、浸提 香精油、香料或净油、蛋白水解物、馏出液以及食品通过烘焙、加热或酶作用而 产生的含有香料的物质，其在食品中的主要功能是调香而非营养作用。这些天然 物质指香辛料、果汁、蔬菜或菜汁、食用酵母、草药、树木的根、茎、叶、芽或 类似的植物材料、肉类、海产类、禽蓄、蛋类、奶制品或发酵产品”。生物转化法生产香料正好可以满足这些要求，这些制备香精香料的生物方 法大致可分为以下

3、三类：一、生物催化法合成；二、借助微生物细胞发酵；三、 通过植物细胞或者组织提取。生物催化法是指采用生物催化剂，即酶作用于天然物质，通过合成或分解 反应而获得天然香料的方法。生物催化法有许多优点。首先，该法生产的香料是 全天然的；其次，采用的催化剂酶可在温和的反应条件常温、常压和正常值范围 下进行，且催化效率相当高，具有很强的立体专一性和区域、对应体选择性;第 三，香料生成过程中的副产物少，易于分离纯化，而且，即使有副产物，也是天 然无害的；第四，生物催化法能生产品种多样的香料，几乎所有的细胞成分都能 通过分解和合成反应产生香料物质。生物催化技术在香精香料应用方面，其中脂 肪酶（Lipase）

4、占很大比例。2脂肪酶的催化特性脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，其主要来源是微生物、哺乳动物、 植物。脂肪酶可催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、 转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性。作为一种 被广泛应用的生物催化剂，其在生物、化学、制药、食品、香料等各行业都有重 要应用。在香精香料行业中，生物催化由于具有反应条件温和、高度选择性、 产物纯度高等优点，可以完成很多化学反应不能达到的效果而被广泛使用。不同来源的脂肪酶可催化同一反应，但在相同反应条件下，催化效率不同。 从已知结构的几种脂肪酶来看，分子量在2000060000之间的脂肪酶作用在体系 的亲

5、水-疏水界面层，这是区别于酯酶的一个特征。脂肪酶的催化部位含有亲核 催化三联体（Ser - His - Asp）或（Ser- His - Glu）。催化部位被埋在分子中， 表面被相对疏水的氨基酸残基形成的a螺旋盖状结构覆盖，对三联体催化部位起 保护作用。界面活化现象可提高催化部位附近的疏水性，导致a螺旋再定向，从 而暴露出催化部位；界面的存在，还可以使酶形成不完全的水化层，这有利于疏 水性底物的脂肪族侧链折叠到酶分子表面，使酶催化易于进行。3酶解机理乳脂肪的主要成分和脂肪酸甘油三醋（约占55%左右）、不饱和脂肪酸甘油 三醋（约占43%左右）、酮酸甘油三酯（约占1%左右）、羟酸甘油三醋（约占1%

6、 左右），这些脂肪酸甘油三醋在脂肪酶的作用下水解成各种饱和及不饱和脂肪酸， 其中C4、C6、C8、C10、C12、C14含量较丰富，它们具有较高的香气贡献度，是 构成乳香的主要因素。通常短链脂肪酸会产生干酪和奶油的香气，而长链脂肪酸 对风味也起着重要的作用。短链脂肪酸与长链脂肪酸的比例也是影响酶解乳脂风 味的重要因素，同时它也能够反映出酶解程度，即酶的利用率。B -酮酸在进一步 反应中又生成各种甲基酮类，主要有甲基戌酮、甲基庚酮、甲基壬酮、甲基十一 酮等等。羟酸生成各种6-内酯、Y-内酯，其中有6-辛内酯、&-内酯类、6- 十二内酯等偶碳内酯。虽然这些甲基酮类和6、y-内酯含量不高，但对形成奶

7、 香的贡献却很大。其反应式为：QHOH 卜 3RCOOHCH.OCOR I(1)C?HOCOR +3HQ型哗CH.OC：OR脂肪酸甘油二能r水甘油+ 3R8OH脂肪酶(2)火-酮酸甘油三酯 /?-嗣酸.? ?谜一步反应：R - C-CH.-CGC.H -R - C - CH,P-酮醒汨基斓类4奶味香原料的制备工艺流程:5影响因素51脂肪酶的筛选脂肪酶简称脂酶，它分别来源于动物胰脏与微生物。用微生物的脂肪酶比较 经济。其中有根霉(Rhigopus)、酵母菌(Yeast)、细菌(Bacteria)及放线菌 (Actinomyces)产生的脂肪酶。对奶香贡献较大的为C4C12的脂肪酸，C16以上 的

8、饱和脂肪酸会带来皂臭味等不良气味从而影响最终的香气质量，应尽量减少其 生成。不同微生物来源的脂肪酶由于酶活中心结构的差异，水解相同的甘油三酯 所表现出的脂肪酸特异性不同。选择出对中短链脂肪酸具有较强水解能力的脂肪 酶，是制备纯正、浓郁奶味香基的前提。5.2温度7 1 40455D556065温度也) 图1温度对酶解反应的影响酶类对温度比较敏感，温度过高会使脂肪酶钝化;温度过低会抑制酶的活性， 同时也会影响底物的黏度，从而影响传质速度。从图1来看，在4550C范围内， 温度的升高有利于反应的进行，酶促反应后风味也随之增强；在50C下，酶促反 应的风味最佳。但过高的温度对风味的生成也不利。这可能是

9、由于随着温度的升 高，脂肪酶变性失活的速度也迅速增加，在超过酶的适宜温度范围时，酶失活速 度比反应速度大得多，从而使酶促反应速度急剧下降。5.3催化时间用脂肪酶催化生成奶味香原料时，酶的作用时间对风味的形成也有较大的影 响。从理论上来说，酶促时间越长，脂肪酶酶解越彻底。实际上，由于脂肪酶解 过程比较复杂，过长的反应时间，可能会造成不良风味物质的生成增多，影响香 精的整体风味，所以不一定是时间越长越好，且浪费时间，增加成本。但如果作 用时间过短，使得反应程度不足，风味物质生成太少，风味没有充分形成。所以要达到理想的风味，反应时间应控制好。5.4 pH值研究表明，有机相中酶最适pH与水相中酶催化的

10、最适pH是一致的。这样在有 机溶剂中酶分子表面的必需水，在特定的pH和离子强度下，酶分子活性中心周围 的基团处于最佳的离子化状态，有利于酶活性的表现。酶在有机溶剂中能保持其 制备的pH不变，可记忆其制备时的pH。在用脂肪酶来催化生成奶味香原料时，体 系的pH对风味物质的生成有很大的影响。油脂的水解产物主要是脂肪酸，如果pH 过高，脂肪酸会与OH-反应生成脂肪盐。在酸性条件下酶解和碱性条件下酶解，自 然会有不同的结果。5.5水如果底物在水中溶解性很差，或水是反应的一种产物，那么反应生成产物在 含水体系中产率一般很低Iwa i等用各种脂肪酸和萜醇在水体系中酯化的研究表 明，大多数脂肪酶没有活性或活

11、性很低。水含量对脂肪酶的影响可以从两个方面加以分析。一方面，酶需要少量的水 以保持活性的三维结构状态，水可以保持催化部位的整体性、催化部位的极化、 蛋白质的稳定。另一方面，水的存在限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性； 在酯化或水解反应中，水含量会影响反应的平衡点及产物在介质中的扩散，过量 水会导致酶的热力学失活。脂肪酶适宜的含水量一必需水随酶源不同会有明显变 化。大量研究结果表明，有机介质中酶催化反应具有酶在水中所具备的优点外， 还具有如下的特点：提高了非极性底物的溶解度；热力学平衡向合成方向移 动；抑制了有水参与的副反应；酶易回收再利用；容易从低沸点的有机溶 剂中分离纯化产物；热稳定性显著

12、提高，pH的适应性扩大；无微生物的污染。所谓非水介质并不是绝对无水，酶维持活性有赖于其活性构象的维持，而酶 的活性构象的形成是依赖于各种氢键、疏水键等非共价相互作用。水参与了氢键 的形成，而疏水相互作用也只有在有水参与时才能形成。因此，水分子与酶分子 的活性构象形成有关。其实与酶分子起作用的只是与酶分子紧密接触的一层束缚 水，只要保证这些基本必需的水分子固定在酶分子表面，而水溶液中其他大部分 的自由水尽可以被有机溶剂所代替。5.6酶添加量图4酶量对酶解反应的影响脂肪酶催化生成奶味香原料时，其用量对风味有较大影响。脂肪酶用量少时， 风味物质生成量少，奶味较淡；用量过多，虽然可以生成大量的风味物质

13、，但会 引起其他不良现象的产生，如产生不良的风味；再者，由于酶用量过多，也会增 加生产成本。5.7酶载体由于脂肪酶价格昂贵，因此，酶再生与再利用是必须解决的问题。固定化脂 肪酶在一定程度上可减少溶剂导致的酶失活，可以使酶在反应介质中均匀存在， 存在的主要问题是由于酶的失活及解吸，酶活性随循环次数而下降。载体材料一般要求有较高的机械强度；由于有机溶剂的存在，要求有较高的 化学隋性；载体材料应易于酶活性再生；载体材料影响酶附近的水含量，材料上 吸附适当的水对保持酶活性有益；载体材料还会影响反应物和产物的分配。6当前研究进展6.1超临界流体状态下的酶反应超临界流体状态下的酶反应是近几年来生物工程新开

14、拓的领域。超临界流体 具有类似液体的密度，类似气体的扩散性和粘度，因此显示出较大的溶解能力和 较高的传递特性，从而大大降低酶反应过程的传质阻力，提高酶反应速率；反应 底物的溶解性对超临界的操作条件（如温度、压力）特别敏感，通过简单改变操 作条件或附加其它设备就可达到反应产物和底物、副产物分离的目的。在酶催化 领域，通过采用超临界CO2作溶剂，它具有无毒、不可燃、化学惰性、易与反应 底物分离、价格便宜等特点，可克服有机溶剂的毒性及价格高的缺点，且高压连 续式的反应操作更是有利于工业化的生产。Hammard等率先提出了超临界CO2可作为酶法酯交换反应介质，接着Nakamura 报道了脂肪酶催化甘油

15、三酯酶交换反应的研究结果。越来越多的研究显示了超临 界CO2下脂酶催化的反应具有广阔应用前景。6.2微生物发酵与酶法结合目前酶法是生产天然奶味香原料的常用方法，但酶法制备的奶味香原料多以 中短链游离脂肪酸为主要香气成分，香气强度大，但香型单调，容易出现油味及 酸败味。利用微生物发酵法生产食品香料近几年发展较快，微生物代谢过程中发 生一系列复杂的反应，产生的香气柔和更宜被大众接受，但风味物质发酵产率较 低，香气强度不够。因此将微生物发酵与酶法相结合是制备高质量天然奶味香原 料的重要途径。奶味香气的特征香气化合物以丁二酮、3羟基丁酮（乙偶姻） 为主，丁二酮可通过乳酸菌发酵产生。目前国内外的研究主要集中在如何提高发酵乳中丁二酮含量方面，而较少将 微生物发酵合成丁二酮的方法应用到天然香精香料的研制中。有学者研究选用具 有合成丁二酮能力的乳酸菌株为发酵菌株，以全脂乳为发酵原料并进一步利用脂 肪酶对发酵液进行修饰，制备奶香纯正、浓郁的