胶原蛋白中蛋白质含量和成分分析鉴定

1、胶原蛋白中蛋白质含量和成分分析鉴定摘要：胶原蛋白是保健品中的明星分子，是由动物结缔组织提取而来。对皮肤 表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性、良好的生物相容性和生物 降解安全性，可降解吸收，适应性强，在生物医学材料、组织工程、美容、食品 等方面都具有良好的发展前景和较高的研究价值。本实验使用实验室以猪皮为原 料制备的胶原蛋白为样本，对胶原蛋白的定量分析和鉴定，认识其生化性质，熟 悉其蛋白组成，以便更好地辨识目前市场上的胶原蛋白产品。关键词：胶原蛋白，考马斯亮蓝，聚丙烯酰胺电泳，1引言胶原蛋白是生物高分子，动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含 量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋

2、白质总量的25%30%，某些生物体甚至 高达80%以上。胶原蛋白应用广泛。作为肌体自然蛋白，它还具有生物降解性、止血性能、 对皮肤表面的蛋白质分子具有较大的亲和力、较弱的抗原性和良好的生物相容性， 可降解吸收，粘着力好；胶原蛋白亦可用于食品，具有适用于食品的一些属性。胶原蛋白有着巨大的生物化学作用与潜质、良好的发展前景。目前胶原蛋白 是保健品中的明星分子，产品众多。但如何认识胶原蛋白的组成，如何了解它的 功能以及如何辨识真伪是消费者遇到的问题。本实验以猪皮为原料制备的胶原蛋 白为实验材料，对其进行蛋白定量分析和鉴定，从而认识其生化性质，熟悉其蛋 白组成，以便更好地辨识目前市场上的胶原蛋白产品。

3、2胶原蛋白的含量测定2.1考马斯亮蓝法2.1.1实验用品标准蛋白质溶液：5.0 mg/mL的牛血清蛋白(BSA)考马斯亮蓝G-250染料试剂可见光分光光度计；比色管；移液器。2.1.2标准蛋白溶液的配制精密称取牛血清白蛋白0.25g，倒入蒸馏水到试管中定容至50ml，配制成浓 度为5.0mg/mL的标准蛋白质溶液。用该标准蛋白溶液二倍梯度稀释，得到浓度一 分别为 2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL 的标 准蛋白溶液。2.1.3考马斯亮蓝G-250溶液的配制称取考马斯亮蓝G-250 5.0mg，然后将其倒入烧杯中，加入2.

4、5mL 95%的乙醇 溶解和6.0mL 85%的磷酸溶解，再用蒸馏水稀释50mL备用。2.1.4标准曲线的绘制取6支试管按表3所示分别加入标准蛋白溶液(如表1)，再分别向这6支 试管中加入0.9mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀振荡后放置10min左右，将溶液 倒入比色皿中，在A595nm处测定吸光度。横坐标为蛋白质浓度，纵坐标为吸光 度，根据测出的数据使用软件绘制出标准曲线。表1标准蛋白溶液、蒸馏水、蛋白质浓度由以上数据可得出标准曲线如下：图1考马斯亮蓝法标准曲线2.1.5样品测定称量0.15g胶原蛋白粉于试管中，然后将生理盐水倒入试管中定容至50mL，摇匀振荡后 等待测量。取3支试管，往试

5、管中分别加入胶原蛋白溶液0.1mL、考马斯亮蓝G-250溶液0.9 mL, 摇匀混合，放置10min后在595nm下比色，测定出样品吸光度为0.190。将该数据代入标准 曲线，可得样品浓度约为0.023mg/mL。2.2紫外分光光度法2.2.1实验用品：5mg/mL的标准蛋白溶液等、胶原蛋白样品溶液、紫外分光光度仪。2.2.2标准蛋白溶液的配制配制出浓度为5.0mg/mL的标准蛋白质溶液，用该标准蛋白溶液二倍梯度稀释，得到浓度分别为 2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL 的标准蛋白溶液。2.2.3样品溶液的准备将样品溶液平

6、均分为三份，记为样品A、样品B、样品C。2.2.4吸收曲线的绘制首先用紫外分光光度仪测定胶原蛋白样品溶液在250nm-350nm之间的吸光度并利用电脑 绘制曲线，确定最大吸收峰。波谱扫描结果如下：图2胶原蛋白光谱扫描曲线结果显示，280nm处测试样品有最大吸收峰。2.2.5标准曲线的绘制用紫外分光光度仪测定6种浓度的标准蛋白溶液在280nm下的吸光度，以浓度为横坐标， 吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。数据如表2。表2牛血清白蛋白吸光度与浓度数据绘制出标准曲线如下图：图3紫外分光光度法标准曲线2.2.6样品测定用紫外分光光度仪测定相同体积样品溶液在280nm下的吸收度，平行测三次，数据如下:取平

7、均值得吸光度为0.475,将该吸光度代入标准曲线可得：样品可溶性蛋白浓度为 1.931mg/mL。3 SDS法分析和鉴定胶原蛋白的成分3.1 SDS电泳法测定胶原蛋白成分试剂的配制、凝胶板的灌制、电泳操作和电泳胶的染色、脱色参照汪建雄，隋秀芝，陈 育晖的用SDS电泳法测定小分子多肽分子量的研究。3.2电泳结果图4 12% SDS分析胶原蛋白样品的图谱可以看到：提取胶原蛋白，分子量较大的集中在95kDa180kDa间，符合没有水解的胶原 蛋白特点；电泳谱带上可以清楚地看到a1和a2组分，且a1的分子量为130 kDa，a2的分 子量为110 kDa。4讨论和分析4.1测定方法方面的讨论4.1.1

8、溶液浓度问题：胶原蛋白浓度过低导致电泳图谱痕迹过淡，模糊不清，不易看出其 条带分布与数目。4.1.2不同含量测定方法导致的偏差：考马斯亮蓝法与紫外分光光度法的原理不同。考马 斯亮蓝法的原理是考马斯亮蓝染料与蛋白质结合而导致最大吸收峰的变化，这种方法无法测 出氨基酸、小肽等的含量，而紫外分光光度法则可以测出样品中的氨基酸、小肽等的存在。 而且胶原蛋白恰恰含有大量氨基酸和小肽，所以用紫外分光光度法测出的蛋白质浓度高于用 考马斯亮蓝法测出的结果。4.1.3操作问题：操作不熟练而导致误差的存在。例如，测定蛋白浓度时，用移液器加样 时，移液体积不准确。4.2实验认识方面通过本次的学习研究，对胶原蛋白这一

9、重要蛋白质有了更好更深入的认识，即目前市场 上的胶原蛋白，多以小肽和氨基酸的形式存在，有利于肠胃或者皮肤吸收。大量小肽和氨基酸的存在，会使用紫外分光光度法和考马斯亮蓝发含量测定产生比较大 的偏差。提取和制备过程中，没有被降解或者消化的胶原蛋白，分子量范围为95kDa180kDa， 符合胶原蛋白的分子量范围。对胶原蛋白理化性质的研究，使我对于生物化学方面的研究工作、实验室操作等有了更 深的认识与体会。参考文献：张秋红等.酸枣仁中蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析J.中国现代中药，2017 (7)： 972-977，991.袁野等.胶原蛋白检测方法研究进展J.明胶科学与技术，2014(4): 175-180.李莹莹等.白果蛋白质提取及SDS分析J.食品科学，2