最新：液体活检在妇科肿瘤早期筛查中的意义（全文）

1、最新：液体活检在妇科肿瘤早期筛查中的意义(全文)妇科恶性肿瘤的早期精准诊断，一直是困扰人类健康的一大问题。基于高效 经济的早期诊断基础上的早期治疗，是患者获得良好预后的基本 保障。然而迄今为止，如何进行妇科肿瘤的早期筛查一直是困扰基础与临 床研究工作的热点。近年来，由于二代测序技术的飞速开展，目前液体 活检技术初现端倪，在各种类型的肿瘤中均有研究，其具有无创、精准 的特性，既可作为筛查手段，又可指导精准治疗，还可以提示疾病预后, 从为数不多的研究中崭露头角，拥有其他检测技术不可比较的独到优势。 本文综述了液体活检在妇科肿瘤的早期筛查中的作用和意义。1关于“液体活检“液体活检(Liquidbio

2、psy )是一种新兴的无创检测技术，MIT TechnologyReview杂志将其列为2015年度十大突破技术之一。该项技 术是通过采集患者体液(包括血液、唾液、汗液及分泌物等)对体内的肿 瘤或移植器官状态进行监测的方法。目前常见的检测工程包括循环肿瘤细 胞(Circulatingtumor cell, CTCs 循环肿瘤 DNA ( Circulating tumor DNA, ctDNA )及肿瘤细胞来源的外泌体(tumorcell-drived exosomes, TEXs )等。目前在临床上已开展的产前无创基因检测即为液体活检的标志 性应用之一。ctDNA的特性与检测方法ctDNA的

3、特性ctDNA是肿瘤细胞脱落于循环血液中的DNA片段。正常状况下，人的体液内即存在有游离的双链DNA片段(cell free DNA),称为cfDNA ,这些片段长度小于正常的DNA，但是携带有正常 的基因组信息1。健康人体内的cfDNA含量很低，主要来源于坏死细胞 和凋亡细胞。而研究者发现恶性肿瘤患者体内的cfDNA量显著高于非肿 瘤患者3。ctDNA来源于肿瘤细胞，是cfDNA的一局部，仅见于肿瘤患 者体内。ctDNA携带有肿瘤细胞的基因组片段，这意味着含有肿瘤特异性 的突变，通过检测ctDNA水平及特征性的突变可以实现对肿瘤的诊断及 检测。一般认为ctDNA在早期病症出现之前就已经出现在

4、循环中，因此 早期对ctDNA检测可以实现肿瘤的筛查。最新的一项研究通过对cfDNA进行深度测序，绘制了人类的核小体 基因组图谱，结果说明cfDNA中的核小体带有其来源细胞的基因印记， 通过分析这种印记可以明确其组织学来源。这项技术假设应用于肿瘤筛查中, 那么在初诊时不仅可以明确肿瘤性质，还可以获得组织学类型、解剖位置 等信息，直接指导后续相关的治疗引。ctDNA的检测方法近年来,不同的研究说明ctDNA在某些类型 的肿瘤中可以作为特异性的分子标记物，如肺癌、胰腺癌、结肠癌等。由 于不同类型肿瘤ctDNA显现出不同的生物学特性,需要用不同的手段检 测。Natrue上发表的一篇文章总结了目前ct

5、DNA的检测方法，包括 cfDNA定量检测；肿瘤特异性杂合性丧失(loss of heterogeneous,LOH );肿瘤特异性基因突变检测；DNA完整性改变检测;表观遗 传学改变检测，如甲基化；循环核小体检测；病毒DNA检测等4。 其中cfDNA定量、表观遗传学改变及病毒DNA检测常用于妇科恶性肿瘤 的诊断与筛查的相关研究。ctDNA与妇科恶性肿瘤ctDNA与卵巢癌 卵巢癌起病隐匿，早期通常无病症，绝大多 数患者因病症就诊时往往已届晚期。目前常用的筛查方法包括CA125、 HE4、经阴道超声等联合应用，尽管如此卵巢癌的筛查方法一直没有实质 性突破，因此医成为目前研究的热点与焦点。Kama

6、t等5通过实时荧光定量PCR的方法发现卵巢癌患者血浆中 cfDNA水平与良性肿瘤患者或健康对照相比显著升高，而且在早期即有明 显差异。假设以cfDNA 4z500GE/ml为筛查界值敏感性可以到达87% , 与CA125相似。此外，假设cfDNA 22,000GE/ml常常预示着晚期或高级 别肿瘤，预后相对较差。由此可见ctDNA的定量检测不仅可以用于卵巢 癌筛查，对指导预后也有一定意义。许多研究曾报道卵巢癌细胞的某些基因存在异常的甲基化现象，包括 BRCA1、MLH1、HOXA9、RASSF1A、SPARC、HIC1、DAPK、OPCML、 CCBE1等基因。DNA甲基化是指在DNA甲基转移

7、酶的催化下，以S- 腺昔-L-甲硫氨酸为甲基供体，将胞密1 定转化为5-甲基胞口密碇的过程。这 种过程虽然不能改变DNA序列，但是却能调控基因的表达，属于表观遗 传学的范畴。当抑癌基因启动子区发生异常甲基化时，能够影响启动子与 转录因子的结合，使抑癌基因失活，这一过程与卵巢癌的形成与开展密切 相关。有研究者对50例卵巢癌患者的肿瘤样本及术前的血清或血浆、腹 水或腹腔冲洗液通过甲基化特异性PCR( MSP )的方法进行特定基因的检测，在68%的样本中发现了 BRCA1或RASSF1A中至少一个的甲基化异常。对其余样本继续检测APC、pl6、pl8和DAPK基因，均发现了至少 一个基因存在超甲基化

8、。由此研究者认为，假设对这六种基因进行联合筛查, 敏感性即可到达100%刀。ZhangQ等8采集202例卵巢癌患者的术前 血清样本，通过 multiplex-MSP 的方法，对 APC,、RASSF1A,、CDH1、RUNX3、 TFPI2、RUNX3、 TFPI2、SFRP5和OPCML基因进行联合检测，得到的敏感性和特异性分别为85.3%和90.5% ,显著优于单用CA125进行筛查。此 外,LiggettTE等9人使用微阵列法对90例卵巢癌样本的血浆进行检测， 结果说明RASSF1A. CALCA和EP300基因的启动子异常甲基化可以联 合用于卵巢癌筛查，其敏感性和特异性为90.0%和8

9、6.7%。DNA的异常甲基化在卵巢癌早期无病症时即可发生，通过液体活检 的手段,可以无创地检测出ctDNA的异常甲基化。并且通过对几个不同 基因的联合筛查，能够提高检测效力。ctDNA与宫颈癌 目前认为，宫颈癌一种与高危型人乳头瘤病 毒(humanpapillomavirus , HPV )感染相关的疾病,其中最常见的类型 为HPV-16. 18型。除了宫颈分泌物之外，宫颈癌患者的血清中也含有 HPV DNA ,相关研究认为存在于血清中的HPV DNA来源于肿瘤细胞， 因为血清中HPVDNA类型与肿瘤组织相同。因此可以通过定量检测血清 HPVDNA替代ctDNA的定量检测。宫颈癌患者血清中HP

10、V DNA的阳性率较低,在一项纳入58例宫颈 癌患者的研究中 肿瘤组织HPVDNA阳性率为94.8%，而血清HPV DNA 阳性率仅为11.8% ,且CIN患者均为阴性10。另一项来自印度的研究纳 入了 100名巴氏涂片结果异常的患者,用实时荧光定量PCR的方法检测 16、18、33、52型HPV DNA ,以E6为引物进行扩增,结果阳性率为 19%，均为HPV-16型或HPV-18型；定量检测结果说明血清HPVDNA 的载量在晚期患者中显著上升11。由此可见，血清HPV DNA与宫颈癌 的进展存在一定相关性，定量检测HPVDNA不仅可以辅助诊断，还能够 判断疾病进展。随着研究的完善,血清HP

11、VDNA或许有望成为宫颈癌的 分子标志物之一。仅有HPV感染并不能导致宫颈癌，肿瘤的发生必然伴随着遗传物质 的改变。许多研究说明宫颈癌细胞基因组中同样存在异常的甲基化，包括 抑癌基因启动子过甲基化导致抑癌基因失活等。通过液体活检的方法可以 检测血中异常甲基化的基因，从而到达早期诊断的目的，但是筛查哪些基 因目前没有定论。有研究者纳入109例低级别与高级别宫颈病变的组织学 标本进行检测，发现 SOX1,PAX1, LMX1A, NKX6-1, WT1 和 0NECUT1 六种基因，其甲基化程度与对照组有明显差异12。这一结果可以应用于 液体活检中，通过测定患者血清中是否含有这六种基因的甲基化异常

12、，但 需要进一步研究证实其敏感性及特异性。一项同时检测宫颈癌患者肿瘤组织和术前血浆样本中DAPK, pl6,和MGMT基因启动子甲基化现象,结果说明这三种基因甲基化在组织学上的阳性率分别为60%, 28.2%,和18.8% ,而在血浆中阳性率仅为40%, 10%,和7.5%13O另一项相关研究那么选取了血清CALCA、hTERT、MYODI、PGR和TIMP3进行联合筛查,结果说明93份宫颈癌患者血清样本中，有81份（87% ）中存在有异常的甲基化,其中MYOD1甲基化 常见于晚期宫颈癌中而血清MYOD1甲基化阴性的患者较MYOD1甲基 化阳性患者无进展生存期和总生存期均延长14。由此可见通过

13、检测血浆 或血清中抑癌基因启动子甲基化，不仅可用以宫颈癌的诊断、筛查，而且 对判断预后有一定帮助，但是如何确定候选基因尚有待进一步的研究证实。ctDNA与子宫内膜癌 近年来，子宫内膜癌的发病率逐年上升。 大多数子宫内膜癌患者早期即出现病症，如阴道不规那么流血或排液。超声 影像学检查在筛查与发现子宫内膜癌具有独到的优势，具体表现为无创、 经济、敏感性与特异性高。假设超声筛查阳性，可以通过刮宫术或宫腔镜监 视下活检，协同提高子宫内膜癌的早期诊断。有研究通过对子宫内膜癌患者及良性病变患者行cfDNA定量检测， 结果说明子宫内膜癌患者cfDNA定量略高于良性病变患者，但是无统计 学意义（P=0.095

14、 ）;患者术前和术后相比，cfDNA水平差异也不具有统 计学意义15。该研究说明ctDNA定量在子宫内膜癌筛查中的应用存在 一定局限性，基于目前的研究水平，须考虑运用其他传统的检查方法。子宫内膜癌患者血清中同样存在有异常甲基化的DNA片段，但是相 关研究甚少。一方面由于子宫内膜癌早期病症明确，常规人群不需要进行 筛查；另一方面通过宫腔灌洗液或子宫内膜活检的方法可以简单、方便的 获得细胞学标本，对组织学标本的DNA检测较血清或血浆中更为精确。 所以目前认为循环肿瘤DNA的检测并不适用于子宫内膜癌的早期筛查。 值得一提的是，特殊类型的子宫内膜癌，如浆液性癌，其侵袭转移能力强， 早期即可发生盆腔转移

15、。假设能通过ctDNA对这些特殊类型的子宫内膜癌 进行筛查，临床意义更大16。3未来与展望循环肿瘤DNA检测通过采集患者外周血，即可获得体内肿瘤细胞的基因组信息，是一种突破性的革新技术。与传统的穿刺活检等方法比较, 液体活检具有以下独到的优势：无创，防止了传统方法为患者带来的不 适；取样全面，一次性采集体内肿瘤细胞的全部信息，防止肿瘤异质性 带来的取样不全；精准，直接获得肿瘤基因组信息，同时用于指导后续 靶向治疗；早期即可在血中检出，甚至早于影像学发现，可以用于癌症的早期筛查；通过对多种基因联合筛查可以提高敏感度及特异度。但是，循环肿瘤DNA检测作为一种新兴技术，仍存在着许多问题。首先这项技术

16、目前只停留在试验阶段，缺乏统一的标准。如对于血样采集、DNA别离、检测手段等，不同试验研究中异质性非常大，相互缺乏可比性。其次，肿瘤的异质性决定了其基因突变位点多而复杂，如何确定最优的候选基因需要研究者们的进一步研究。的候选基因需要研究者们的进一步研究。最后，目前对于循环肿瘤DNA的检测技术的精确度仍不完善，组织学与血液学结果存在显著差异。因此, 有研究者对ctDNA的应用前景提出了疑问，即肿瘤进展的不同阶段会产 生不同的突变，凡此均增加了 ctDNA检测的复杂性;另外，作为一种尚 臻完善的技术与方法，如假设贸然普及应用于健康人群的筛查，那么筛查阳 性人群的后续当如何处理，或许存在伦理学的冲突，假设立即积极处理，是 否存在过度治疗，影响患者的生活质量，特别是在经验不成熟时，医生应 怎样稳妥的处理和对待这些，都是未来需要进一