紫薇叶天然抗氧化物的提取

1、浴:】宗人尢亨班级：应用化学112姓名：周明杰学 号：201111030216指导老师：王志坤紫薇叶总黄酮的超声提取及其抗氧化研究周明杰201111030216理学院应用化学112班摘要：目的探讨紫薇叶中总黄酮的提取、鉴别方法及对超氧阴离子自由基的清 除能力，以充分利用紫薇叶植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸 提法从紫薇叶中提取黄酮类化合物，用分光光度法测定黄酮类化合物的总含量， 并利用对羟自由基的清除能力来进行紫薇叶总黄酮的抗氧化性的研究。结果测得 样品中黄酮类化合物的总含量为C = 0. 292mg/ml，回收率为72.01%，其纯度和 产率均较高。结论该方法采用全物理过程，无

2、任何污染，是提取紫薇叶中黄酮类 化合物的有效途径。紫薇叶黄酮类化合物提取液对Fenton体系产生的OH自由 基有很好的清除作用。关键词：紫薇叶；总黄酮；鉴别；超声波提取；清除；自由基紫薇，别名入惊儿树、百日红、满堂红、痒痒树。为千屈菜科紫薇属双子 叶植物。产于亚洲南部及澳洲北部。中国华东、华中、华南及西南均有分布， 各地普遍栽培。紫薇树姿优美，树十光滑洁净，花色艳丽；开花时正当夏秋少 花季节，花期极长，由6月可开至9月，故有“百日红”之称，又有“盛夏绿遮眼， 此花红满堂”的赞语，是观花、观干、观根的盆景良材。紫薇也是河南安阳市、 湖北襄阳和山西晋城市市花。紫薇常见的名字为百日红，因百日红的含义

3、较好，所以人们广泛称为百日 红，耐旱、怕涝，喜温暖潮润，喜光，喜肥，对二氧化硫、氟化氢及氮气的抗 性强，能吸入有害气体，中性土或偏酸性土较好。据测定，每千克叶能吸硫10 克而生长良好。紫薇又能吸滞粉尘，在水泥厂内距污染源200250米处，每平方 米叶片可吸滞粉尘4042克。因此，它是城市、工矿绿化最理想的树种，也可作盆 景。紫薇还具有药物作用，李时珍在本草纲目中论述，其皮、木、花有活 血通经、止痛、消肿、解毒作用。种子可制农药，有驱杀害虫的功效。叶治白 痢、花治产后血崩不止、小儿烂头胎毒，根治痈肿疮毒，可谓浑身是宝。本文首次将超声技术用于紫薇叶总黄酮的提取当中，同时对黄酮提取物 进行体外抗氧化

4、性研究，为紫薇叶的有效利用提供了一些理论依据。1材料与仪器1材料、试剂与仪器紫薇叶采自浙江农林大学校园，将采集来的紫薇叶置于自然状态下风干，然 后再置于粉碎机磨细至全部能通过10目筛的细末。用标准筛选，截取能通过40 目筛但不能通过60目筛的部分，风干，贮于具有磨砂玻塞的广口瓶中，瓶上贴好 标签，注明样品名称、来源、采样日期等。留供分析试验用。芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)。石油醚、丙酮、乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、葡萄糖、硫酸亚铁、 双氧水、PBS缓冲溶液(pH7.4)、邻二氮菲、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(tris) 等均为国产分析纯，并由华东医药股份有限公司提供。T-6新世纪

5、紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司生产)；KQ-250DB型超声波清洗仪（西安安泰仪器科技有限公司）；SHZ-C循环水式 多用真空泵（河南巩义市宇翔仪器有限公司）；DHG-9240A型鼓风干燥箱（上海精 宏实验设备有限公司）；DZG-6050真空干燥器（上海森信实验设备有限公司）； BS224S型电子分析天平（梅特勒-托利多上海仪器有限公司），R201B旋转蒸发器 （江苏金坛市白塔石英玻仪厂）。2方法与结果2.1紫薇叶总黄酮提取将紫薇叶洗净烘干，粉碎，过20目筛，精确称取紫薇叶粉末10 g，加100 ml 95%乙醇，超声波提取2. 0 h，抽滤。滤渣再加100 ml 95%乙醇，超

6、声波继续提取 2. 0 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩20 ml左右为止，置250ml 容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，即得样品液。2定性实验-总黄酮的鉴别2.2.1氨显色反应将紫薇黄酮提取物溶液滴于滤纸上风干，以挥发氨熏滤纸，观察颜色变化。 2.2.2铝盐反应向向紫薇黄酮提取物溶液中加入1 %三氯化铝溶液，观察颜色变化，在300 800 nm波长范围内测定色素溶液加入三氯化铝溶液后的吸光度。2.2.3铁盐反应向紫薇黄酮提取物溶液中滴加醋酸铅和氯化铁水溶液，观察颜色变化。2.2.4碳酸钠反应向黄酮提取物溶液中加入碳酸钠，观察颜色变化。2. 3测定方法以芦丁为对照品测定苦竹叶中

7、总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适 宜pH值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收 峰。2. 4定量实验-总黄酮的含量测定2. 4. 1测定波长的选择精确量取一定量的样品液，在碱性条件下，加入0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液， 经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液，在420-700 nm波长范围测定络合物的 吸光度，结果表明络合物在510 nm波长处有最大吸收峰出现，故测定时选用此波 长为特征吸收峰位置。2. 4. 2标准曲线的制作表1紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度芦丁浓度。/mg-ml-1吸光度0.000.0000.010.1200.020.2720.03

8、0.4450.040.5270.050.824精密称取芦丁20 mg，加60%乙醇水溶液定容至100 ml，从中取出25 ml并且 用蒸馏水稀释至50 ml。再分别吸取0. 00，1. 00，2. 00，3. 00，4. 00，5. 00 ml于 10. 00 ml具塞试管中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0. 30 ml，摇匀，静置6 min ；再 加10%硝酸铝水溶液0. 30 ml，摇匀，静置6 min；再加4%氢氧化钠水溶液4. 00ml,用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置15min后，以试剂为空白，在510 nm 处测吸光度。结果见表1。根据表1可得芦丁浓度(C )与其吸光度(A)具有良好

9、的线性关系，结果见图1。标准芦丁曲线图1芦丁标准曲线芦丁标准样品的线性方程式为：A=14.50C0.012. 4. 3样品含量测定分别精确吸取提取液5 mL于3个50 mL容量瓶中，加入5 %NaNO2溶液1.6 mL，摇匀，放置6 min后加入10 %Al(NO3)3溶液1.6 mL，摇匀，放置6 min，再 加4 % NaOH溶液20 mL，摇匀，显色，以蒸馏水定容至刻度，放置15 min后于 510 nm处测吸光度(以不加芦丁的空白管为对照调零)A，A2，A3，根据回归方 程：A=，计算出黄酮含量，计算紫薇叶总黄酮含量的平均值C= 0. 292mg/ml。2. 4. 4回收率实验精密量取

10、样品液2. 00 ml,加入标准芦丁对照品2. 00 ml (0. 125 mg/ml)，同前 样品测定方法操作测定吸光度，求得的回收率为100. 5%。2. 5紫薇叶黄酮对OH的清除作用参照Fenton反应的方法建立OH.自由基产生体系模型凹。H2O2与二价铁离子 混合后产生OH的Fenton反应为：H2O2+ Fe2+=OH-+OH+Fe3+，OH具有很高的反 应活性，存活时间短，但在反应体系中加入邻二氮菲，能有效地捕捉OH并产生 有色产物，该产物在536 nm处有强吸收，若加入具有清除OH功能的被测物，但 会与邻二氮菲竞争OH.，从而使有色产物的生成量减少。采用固定反应时间法， 在536

11、 nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，便能测定被测物对 OH的清除作用。一 取7支具塞试管，分别加入0.75 mmol L-1邻二氮菲溶液1 mL； pH7.4的PBS 缓冲液3.8 mL，充分混匀后再加0.75 mmol L-1 FeSO4溶液1. 5 mL立即混匀。然后 向其中5支试管分别加入0.4, 0.8，1.2，1.6, 2.0 ml的黄酮溶液，混匀。另2支分 别为损伤和未损伤管，不加黄酮溶液，在损伤管中加入0.01 %H2O2 1 mL，未损 伤管不加H2O2，最后用蒸馏水补至相同体积10 mL，6支试管于37 。保温1 h，测 a536。计算OH清除率。OH清除率=

12、(A2- A1) / ( A0-A1) X 100 %其中A0表示未损伤管的吸光度，A1表示损伤管的吸光度，A2表示加黄酮溶液 的吸光度。3结果与讨论1黄酮类物质定性鉴定结果3.1.1氨显色反应将紫薇叶乙醇提取液滴于滤纸上风干，以挥发氨熏滤纸，立刻产生深黄色， 当滤纸放置久后，因氨的挥发而褪色，这是黄酮类化合物的典型反应。3.1.2铝盐反应向紫薇叶乙醇提取液中加入1 %三氯化铝溶液，有一种黄色可溶性物质生成， 可使溶液吸光度增大，说明有黄酮类物质存在。3.1.3铁盐反应向紫薇叶乙醇提取液中加入氯化铁溶液后，生成了墨绿色的沉淀，放置一段 时间溶液的颜色基本褪去，这也是黄酮类物质的典型反应。3.1

13、. 4碳酸钠反应向紫薇叶乙醇提取液中加入碳酸钠溶液后，出现灰绿色，表明有异黄酮存在。3. 2芦丁标准曲线的建立芦丁质量浓度C和吸光度A的关系，曲线的回归方程为：A=14.50C0.01。说明本检测方法中芦丁浓度与吸光度有良好的相关性。3. 3黄酮类化合物含量测定按2. 4项下进行紫薇叶中总黄酮类物质含量的测定，结果为经过超声提取的 的紫薇叶中总黄酮类物质平均含量为4.01%。3. 4紫薇叶对OH的清除作用按照2. 5的方法测定紫薇叶黄酮对O H的清除作用，实验结果见图2。5 4 3 2 1 0 o o o o O鄙簸- HO图2紫薇叶黄酮对O H的清除作用由图2可以看出在所选质量浓度范围内，紫

14、薇叶黄酮对H2O2/Fe2+体系通过 Fenton反应产生的OH具有清除作用，且紫薇叶黄酮清除OH.的能力随着加入量 的增加而上升，即清除率与黄酮的用量存在着一定的量效关系，说明紫薇叶黄酮 对OH 活性有一定的清除作用。4讨论实验结果表明，超声波辅助提取紫薇叶黄酮类物质的方法，所得产品纯度高， 回收率为72.01%。与常规乙醇提取法相比，超声波可以强化乙醇浸提法，达到省 时、高效、节能的目的，而且新方法采用全物理过程，无任何污染，工艺过程简 单，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效 成分，具有很高的药用价值。在

15、自然界中最常见的是黄酮醇和黄酮，其余结构还 包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮 类等6。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障， 进入脂肪组织，进而表现出诸多功能，如消除疲劳、保护血管、防止动脉硬化、 扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器细胞等 等。因此黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调 节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等功效11， 12。近年来，世界各地掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点备 受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目，紫薇叶分布广泛。本文 实验结果表明，杨梅叶中不仅含有丰富的黄酮类化合物，而且其内含的黄酮物质 对羟自由基具有很好的清除能力。因此，紫薇叶具有广泛开发和利用价值，值得 加强资源开发