酵母菌液态深层通风发酵讲义

1、酵母菌液态深层通风发酵、实验目的1、了解通风搅拌罐的发酵过程2、学习发酵过程各生理指标的测定二、实验器材1分光光度计2发酵罐罐体系统罐身：由硼硅玻璃和不锈钢加工制成。密封件：机械密封、硅橡胶“ O型圈。罐盖布局取样放料口取样回r 口液位电板pH电极接口接箱口消泡电班为度电极2。电极接口接地电极补料口三乾乔料口阀门系统示意图（背面）控温夹套控温夹套由控温夹套、1加热器、2测温电极、3水位电极等组成。灭菌罩灭菌罩（参见图1）由不锈钢罩体、AQ-安全阀、P2-压力表、17测温电极（3） 等组成。管阀系统管阀系统（参见图1）由EWF冷却水电磁阀、7冷凝器进水阀、W溢流水阀、 W2-排水排汽阀、S灭菌罩

2、进蒸汽阀、S2一夹套进蒸汽阀、25蒸汽回汽管、 G-气路调节阀、不锈钢管路、优质胶管、接头等组成。辅助设备：由空气压缩机、蒸汽发生器组成。辅助设备属于选购设备系统安装：发酵罐应安装在通风良好、空气洁净的房间，房间内应经常消毒。将罐体与控制电箱放置在平整桌面上，调节支撑脚确保水平与垂直度。连接进水、排水、空气进气管，并用卡箍固定挟紧，进水端要加水过滤器。将搅拌电机、PH电极、DO电极、泡沫电极、测温电极、水位电极、加热器、 电磁阀的电缆接头连接好。接插好黄绿接地线，保证罐体有良好的接地!2.3发酵罐电气系统（图3）开机和关机（参见图3）在确认发酵罐管路部分和电气部分连接无误后，方可开机进行操作！

3、开机顺序：接通电源，待控制柜上红色电源指示灯亮后再打开控制柜右下方 的红色电源开关，（注意：红色电源指示灯亮后表示控制柜的接线柱电源端子已 有电，千万不可用手触摸该接线端子，以防发生触电事故！）然后打开控制柜右 侧的工控机电源开关启动工控机；进入windows桌面后点击组态王程序并继续进 入发酵程序后暂停操作；（关于发酵控制程序的操作请另见发酵控制系统操作说 明书）。根据实际需要分别打开控制柜右侧的搅拌电机、加热器和蠕动泵、电磁 阀的电源开关；（工控机电源和搅拌电机、加热器、蠕动泵包括电磁阀的电源开 关是分开安装的，如果不需要运行这些部件，则相应的电源开关可以关闭，在此 情况下，工控机仍可以开

4、机运行，但不能驱动执行机构）然后继续进行发酵控制 参数的设定，（关于发酵控制程序的设定请另见发酵控制系统操作说明书）。待 所有控制参数设定完毕并确认无误后再根据要求选择点击各操作界面上的自动 或手动运行按钮进入发酵培养。特别注意：搅拌电机的电源必须在发酵程序运行 前打开，否则可能会造成搅拌电机飞车，损毁搅拌系统。关机顺序：关机时必须先点击各操作界面上的停止按钮， 确认所有控制项目全部 停止后再点击返回按钮回到主菜单界面退出发酵程序；继续退出组态王程序后再退出windows,关闭工控机电源并关闭红色电源开关，(此时控制柜上红色电源 指示灯亮着，控制柜的接线柱电源端子仍然带电)最后切断电源，(此时

5、控制柜上红色电源指示灯熄灭)。三、试剂1% 3, 5-二硝基水杨酸(DNS试剂：洒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸储 水，加热中依次加入 NaOH 5 g, 3, 5-二硝基水杨酸5 g ,苯酚1 g ,亚硫酸钠 0.25 g ,搅拌至溶。冷却后定容至500 mL,储于棕色瓶室温保存。10姗糖溶液NaOH 1mol/l(4)乙酸缓冲液(0.05mol/ml) pH5.0四、操作方法.灭菌准备工作将排水硅胶软管装在排水排气口上。打开排水排汽阀，放尽控温夹套内的剩余水。关闭溢水阀、冷凝器进水阀、灭菌罩进蒸汽阀、夹套进蒸汽阀、蒸汽回汽管堵 头和进空气阀。拔下泡沫电极、液位电极和顶盖接地线的连接插

6、头。取出pH DO电极进行校验，校验完毕后卸下备用。(该步骤在实罐灭菌时操 作)取出测温电极。拧下冷凝器进、出水接头。将进气过滤器、尾气过滤器、尾气滤水瓶安装到位。取样放料装置安装就位。将补料瓶安装上呼吸过滤器。打开蒸汽发生器准备提供蒸汽。.空罐灭菌第一步：装上pH电极孔、DO电极孔、三针补料口的堵头并拧紧。第二步：旋松搅拌电机固定螺栓，卸下电机连接电缆，取下电机，横放在柔软、 干燥桌面上。注意电机和电缆的连接口不能进水，以免发生短路！第三步：卸下温度电极，拧下蒸汽回气管堵头，盖上灭菌罩，拧紧固定螺丝，插 上测温电极。第四步：点击系统运行进入组态王发酵程序主菜单后选择灭菌辅助程序，设置灭菌温度

7、与灭菌时间，点击开始按钮进入灭菌程序运行。第五步：打开排水排气阀，打开灭菌罩进蒸汽阀，然后缓缓打开蒸汽发生器的出 蒸汽总阀让蒸汽不断进入罐内，使罐体温度不断升高。操作时应密切注意灭菌罩 上的压力表指示和控制箱上的温度指示，保证压力不超过0.15Mpa,温度不超过130 Co第六步：当设定的灭菌时间到时，控制柜发出鸣叫报警，此时将蒸汽总阀和灭菌 罩进蒸汽阀关闭。第七步：当确认罐压释放完毕后，将排水排汽阀完全打开，排空夹套内的冷凝水。第八步：灭菌罩温度下降到 90c时卸下灭菌罩的固定螺栓，小心取下灭菌罩， 拧上蒸汽回气管堵头，空消完成。.实罐灭菌空罐灭菌后，应尽快进行实罐灭菌。发酵罐倒入3.0L的

8、如下成分的培养基：发酵培养基：蔗糖20.0g/L蛋白冻5.0 g/LNa2HPO4.0 g/LMgSO40.5 g/LKH2PO1.0 g/LpH4.55.5第一步：装上已校正好的pH DO电极并旋上保护盖。打开排水排汽阀，关闭灭菌罩进蒸汽阀、冷水阀、冷凝器进水阀、进空气阀、夹套溢流阀、拧上蒸汽回气 管堵头。第二步：放入发酵培养液，检查并拧紧顶盖上所有的连接口，不得有泄漏。第三步：连接好尾气过滤瓶并在尾气排放口接上呼吸过滤器，将进气口、取样口、 补料口各胶管弯曲夹紧。第四步：打开工控机电源开关，选择灭菌辅助程序，打开搅拌电机电源开关，设 置灭菌温度与灭菌时间。第五步：打开排水排汽阀，缓缓打开蒸

9、汽发生器的蒸汽总阀，打开夹套进蒸汽阀， 让蒸气不断进入夹套内，适时调整排水排汽阀和夹套进蒸汽阀， 使罐体温度不断 升高。直到升到120c （注意对应压力）。操作时应密切注意灭菌罩上的压力表 指示和控制箱上的温度指示，保证压力不超过 0.2Mpa,温度不超过130C。第六步：当设定的灭菌时间到时切断蒸汽发生器的电源。等蒸汽压力释放，罐体自然冷却。当罐内温度降到 90c以下，确认罐内压力释放完毕后，将排水排汽 阀完全打开，排空夹套内的冷凝水。卸下测温电极的插头，取下灭菌罩，拧上蒸汽回气管堵头，将排水排汽阀关闭，实消完成。.培养准备工作第一步：关闭排水排汽阀，打开溢流水阀，连接好冷凝器进出水管并拧紧

10、。第二步：关闭气路调节阀，连接空气压缩机与发酵罐的进气端。第三步：调整压力调节阀（空压机端）将压力调整至 0.1-0.15MPa。第四步：将进气过滤器与压力表用专用气管连接并用喉箍箍紧。第五步：开气路调节阀，然后松开进气、尾气口胶管夹头，将气量调节至工艺所 需的流量。第六步：安装好搅拌电机和顶盖接地线。第七步：插入测温电极；取下 DO pH电极上的保护盖；连接pH电极、DOfe极、 泡沫电极和电机的连接电缆。第八步：进入发酵程序，设置运行参数，打开需要运行的搅拌电机、加热器、电 磁阀、蠕动泵的电源开关，点击各运行界面的自动或手动按钮进入发酵培养。接种培养第一步：准备好的种子液300ml。第二步

11、：酒精盘内放入无水酒精或酒精棉， 点燃后安放于接种口，适当加大通气 量或减小尾气流量。第三步：打开接种盖，将其放入干净器皿中。第四步：将菌种瓶口放在火焰上烧一下，并在火焰上拔下瓶塞将菌种倒入发酵罐第五步：将接种盖放在火焰上烧一下，盖上接种盖。第六步：按工艺要求恢复正常的罐压和通气量。5检测在发酵过程中有pH电极、溶氧电极在线记录发酵情况；发酵前后通过取样在660nm或者下检测发酵液中细菌浓度的变化；总糖测定：总糖标准曲线制作：显色液制备：将50ml浓硫酸缓缓加入10ml水中冷却至室温，加入0.6g苯酚晶体搅拌使 其溶解配成显色液。标准葡萄糖溶液制备：各配置 0.1 mg/ml、0.15 mg/

12、ml、0.2 mg/ml、0.25 mg/ml、0.3 mg/ml 葡萄 糖溶液。各取上述葡萄糖浓度溶液1ml,分别加5.00ml显色液，震荡混匀。置于沸水浴中 保温3035min,取出，放在冷水浴中，冷却至室温。与 4 9 0 n m 处测定其吸 光度值，将O而为纵坐标与葡萄糖浓度为横坐标做图。样品测定：取1.00ml的待测样品于容量瓶中稀释适当倍数， 再从中取1ml,加入5.00ml 显色液，震荡混匀。置于沸水浴中保温 3035min,取出，放在冷水+浴中，冷 却至室温。与490 n m处测定其吸光度值。所测得的O曲回归上述标准曲线，计 算得出发酵液总糖含量。蔗糖酶产量测定收集发酵液，离心

13、，收集细胞，经过醋酸缓冲液两次洗涤，超声波破碎。离 心收集上精液。表1酶液的酶活力比色管号1234酶液1 mL1 mL1 mL1 mL醋酸 buffer pH52mL1.8 mL1 mL1 mL1 mol/L NaOH1 mL000蔗 糖溶(0.2mol/L)(ml)0.2mL0.2 mL0.2 mL0.2 mL37c准确反应10 min1 mol/L NaOH0mL1 mL1 mL1 mL水杨酸试剂2 mL2 mL2 mL2 mL沸水浴精确反应5 min,冷却后te谷至25 mLA540缓冲液配制溶液pH缓冲试剂体积ml缓冲试剂体积ml4.00.2mol/L 乙酸钠1.800.2mol/L 乙酸8.205.00.2mol/L 乙酸钠7.000.2mol/L 乙酸3.006.00.2mol/L 乙酸钠9.500.2mol/L 乙酸0.507.00.2mol/L 磷酸氢二钠6.100.2mol/L磷酸二氢钠3.90葡萄糖标准曲线的制作2 口 吕勺操作空白标准葡萄糖浓度梯度012345葡萄糖标准液(ml)(1mg/L)0.20.40.60.81.0蒸储水(ml)2.01.81.61.41.21.0DNSU齐1J (ml)各2.0反应