石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞数量及超微结构的影响

1、石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞数量及超微结构的影响刘东京 刘美洲 张阳德 刘东非 潘一峰 陈 伟 刘 辉 曾庆仁 张红*（中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心 长沙 410008） 摘要: 目的 了解石墨碳纳米颗粒(carbon nanoparticles，CNP)的形态特征，观察CNP其对体外培养细胞增殖与超微结构的影响。方法 用原子粒显微镜和电镜观察分析CNP 的大小、形状。选择人肝细胞株（L02）、人肝细胞株（Hl7702）、小鼠细胞株（3T3）和人肝癌细胞株（HepG2）作为观察对象，在体外培养中，将每种细胞株按设计添加不同浓度CNP，每个浓度设3孔。用血细胞计数板计数法测定细胞数量

2、，透射电镜观察细胞超微结构，通过方差分析和Dunnett检验作统计学处理。结果 CNP 约为20nm的球形微粒。添加有不同浓度CNP 的4株细胞各实验组，除HepG2细胞株外，其他三组细胞数量水平均显著多于未添加CNP 的细胞对照组，其中以7.5g/ml浓度组最为突出。透射电镜观察添加浓度为7.5g/ml CNP 的细胞，可见到CNP 分布于细胞内，而未见到对亚细胞结构受损现象。结论 对体外培养细胞的生长繁殖具有促进作用，其作用强度与浓度有关。关键词: 纳米石墨碳；人肝细胞株；人肝癌细胞株；超微结构Effects of Graphite Carbon Nanoparticles on Numb

3、ers and Ultramicrostructure of Cell Growth in VitroonLiu Dong-jing , Liu Mei-zhou, Zhang Yang-de, Liu Dong-fe, Pan Yi-feng, Chen Wei, Liu Hui, Zeng Qing-ren, Zhang-hong*Nathonal Hepatobiliary & Enteric Surgery Research Center Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University; No.87, Xia

4、ngya Road, Changsha, Hunan 410008, P. R. China.Abstract: Objective To investigate the effects of carbon nanoparticles (CNP) on cell proliferation and ultramicrostructure. Methods: Different concentrations of carbon nanoparticles were added into the HepG2 cells、L02 cells、Hl7702 cells and 3T3 cells to

5、 observe the effects of carbon nanoparticles on cell proliferation. The hemacytometry were used to count the number of cells. The cell submicrostructure was observed through transmission electron microscope. Related statistical methods were used to analyze the results. Results: When the medium was a

6、dded with carbon nanoparticles, the number of L02 cells、Hl7702 cells and 3T3 cells increased, reaching the highest when the concentration of carbon nanoparticles was 7.5g /ml. Under the transmission electron microscope, it was found that when the concentration of carbon nanoparticles was 7.5g /ml, t

7、he particles could easily enter the intracellular parts of L02 cells, Hl7702 cells, 3T3 cells and HepG2 cells but had no damage to the cell ultramicrostructure. Conclusion: CNPs have promoting effect on cell growth and their effect is related to the CNP concentration.Keywords: Carbon nanoparticles;

8、Human liver cell line; Human liver cancer cell line; Ultramicrostructure中图分类号： 文献标识码：目前，纳米无定型碳在制作高档油墨、活性剂、催化剂等方面已进入应用阶段。在生物学领域，有学者利用石墨碳纳米颗粒 (carbon nanoparticles，CNP) 作基因或药物载体研究1，2 ，但对其特性与生物相容性尚不十分清楚。本研究目的旨在了解本室制备的CNP 的形态特征基础上1, HYPERLINK 石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞生长特性的影响英文.doc3，重点观察其对体外培养细胞的数量及超微结构的影响，以期为CNP 在

9、医药领域中的运用提供生物安全的实验证据HYPERLINK 石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞生长特性的影响英文.doc4,5。* 通讯作者：张红 E-mail:liudongjing1 材料与方法1.1 CNP的母液配置 取石墨碳纳米颗粒(carbon nanoparticles，CNP；本中心自制）0.5g加100ml三蒸水于塑料杯中，封口后在微型漩涡混合器上振荡5min，用0.45m微孔滤器无菌过滤，置4冰箱保存备用。1.2 CNP粒径、形态与电位的测定 取CNP母液稀释10倍后，用原子粒显微镜（ASYLUM RESEARCH产）测量其粒径，观察其表面形态;电子显微镜下观察CNP的形态特征. 1

10、.3 含不同浓度CNP培养液的配置 取含10 %胎牛血清（杭州四季青产品）、10104UL-1青霉素和100mgL-1 链霉素的RPMI-1640培养基（海克隆产）100ml/瓶，共11瓶，分别加入2ml、1.5ml、1ml、0.5ml、0.4ml、0.3ml、0.25ml、0.2ml、0.15ml、0.1ml和0.0ml CNP 母液，使其分别成为含CNP 浓度为100g/ml、75g/ml、50g/ml、25g/ml、20g/ml、15g/ml、12.5g/ml、10g/ml、7.5g/ml、5g/ml和0。1.4 细胞计数法计数不同浓度CNP作用下的细胞数量 取对数生长期的4种不同细胞株

11、分别调整为5104/ml，接种于6孔培养板，每孔0.5 ml，补充培养基1.5 ml进行培养。培养24 h后，弃去旧液，设1-5号孔为实验组，分别加入浓度为25g/ml、10g/ml、7.5g/ml、5g/ml、0.25g/ml CNP培养液2.0ml，设6号孔为对照组，不加CNP溶液，继续培养24 h后，终止培养。每孔0.25%的胰蛋白酶0.5 ml消化后加入1.5 ml培养基，用移液枪吹打使其细胞均匀，吸取细胞悬液用细胞计数板在光学显微镜下计数。每种细胞株平行设A、B、C 3块6孔板，4种细胞共用12块6孔板。每种细胞株每个剂量水平设3孔培养和细胞计数，取3孔细胞平均数为统计数据。1.5

12、透射电镜观察CNP7.5g/ml浓度作用下细胞的超微结构取对数生长期的HepG2细胞、L02细胞、Hl7702细胞、3T3细胞分别调整为5104/ml密度，加入浓度为7.5g/ml CNP培基液，培养24 h后，用0.25%的胰蛋白酶消化后，移入离心管中，1200 rpm离心6min, 弃去离心管中上清液，向管内滴加2.5%戊二醛固定24 h以上，之后用2%锇酸固定2h，经50%、70%、90%、100%的丙酮梯度脱水，每级3次，每次10min，细胞在环氧树脂混合液：纯丙酮=1:1溶液中，37浸泡24h，之后送交湘雅医学院超微结构教研室进行细胞包埋成块，半薄切片、染色、超薄切片、电子染色后用日

13、立H7500型透射电镜进行观察，采集图片。对照组细胞为不加CNP样本，其余作法同前。1.6数据统计分析 测量结果采用SPSS13.0软件进行统计分析和处理，两组均数间的比较用Dunnett检验，多组均数间的比较用方差分析，以P0.05为差异具有显著性意义。实验数据以均数标准差( s)表示。2 结果2.1 CNP的形态特征用电镜观察和原子粒显微镜测量石墨碳纳米颗粒（CNP）的形态特征，从图1和图2可见CNP呈微小的圆球形，分散良好、分布均匀，其粒径 约20nm。 图1. 原子粒显微镜观察CNP形态图 图2. 电镜观察CNP形态(50000). 2.2 CNP对细胞数量的影响本实验采用细胞计数法分

14、析CNP对细胞生长繁殖数量的影响。所得数据用SPSS13.0软件进行统计分析结果显示，与对照组相比，各实验组的细胞数量，除HepG2细胞外，其余多数有显著增加（P0.05)，其中以添加浓度为7.5g/ml的CNP培养液实验组对L02细胞、Hl7702细胞、3T3细胞、HepG2细胞数量的影响最为显著(见表1)。表1 不同浓度CNP对4种细胞株作用后细胞计数结果(104ml， s)CNP g/ml 25.00 10.00 7.50 5.00 0.25 0.00L02 2.370.64b 3.730.40 b 7.132.40ab 5.060.12ab 4.730.23 2.330.58Hl770

15、2 13.336.42b 18.675.03 26.337.23ab 23.335.51a 21.675.13 10.676.66 3T3 12.003.61b 14.004.58 24.335.31ab 21.004.36a 19.333.51 10.334.16HepG2 9.90.14b 11.550.07b 13.150.78b 16.151.20ab 14.650.85 14.051.34每种细胞株对每个剂量水平设立3孔，细胞数量为3个孔的平均数。各组不同浓度间数据经统计学处理，其差异均有显著性，P0.05。a表示与对照组比较，b表示组间比较。2.3 纳米石墨碳颗粒对细胞亚显微结构的

16、影响对添加浓度为7.5g/mlCNP的细胞做透射电镜观察结果显示，CNP在细胞内部，广泛分布在细胞质，细胞核，线粒体中。细胞膜及核膜未见损伤，线粒体未见损伤，细胞核未见损伤，其他亚显微结构与正常细胞无异，细胞未见有凋亡坏死征象。图3、5为加入CNP的HepG2细胞，图4、6为加入CNP的Hl7702细胞，可见到细胞内部有大量的CNP分布，亦可见CNP成聚集现象。 图3 加入CNP 的HepG2细胞（7000倍） 图4 加入CNP 的Hl7702细胞（5000倍） 图5 加入CNP 培养24h的HepG2细胞（80000倍） 图6 加如CNP培养24h的Hl7702细胞（80000倍）3 讨论迄

17、今为止，国内外对石墨碳纳米颗粒(carbon nanoparticles，CNP)在生物医学领域中的研究较少，仅见用其作基因载体和药物载体的成功研究报道HYPERLINK 石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞生长特性的影响英文.doc6,HYPERLINK 石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞生长特性的影响英文.doc7，也有应用于人体的研究报道，认为CNP的特性，当进入人体后作为异物被巨噬细胞吞噬，到达网状内皮系统后，多分布集中在肝、脾、肺、骨髓、淋巴等器官部位，而且CNP栽药作腹腔化疗时还可以较少引起腹腔炎症和粘连;其反向排出可能对于减少其进入血液,避免引起循环栓塞也是有利的2。亦有研究报道，CNP具有强

18、大的吸附能力，容易与组织细胞吸附。只要尽可能将CNP浓度控制在有效浓度范围内, 该类纳米颗粒将会具有很好的细胞相容性6，明显的催化、增敏效应8。本研究为了解本实验所用CNP的形态特征，进而证明CNP的生物相容性和安全性，在观察CNP形态、粒径和电位基础上，选用了两个人肝细胞株、1个人肝癌细胞株和1个小鼠细胞株作为观察对象，在体外培养条件下，通过添加不同浓度水平CNP和不加CNP来比较了观察CNP对生物体细胞生长与结构的影响。对CNP形态特征观察与测定的结果（图1-图2）表明，CNP粒径在20-50 nm范围内，形态呈微小圆球形，颗粒稳定且分散性良好，具备了优质纳米材料的条件。在体外培养系统中，

19、首先观察了不同浓度水平CNP对4种细胞株繁殖能力的影响差异。直接计数结果（表1）表明，在一定浓度范围内的CNP能对L02细胞、Hl7702细胞和3T3细胞的生长速度具有促进作用，其中在CNP浓度为7.5g/ml时，其促进作用最为明显。但对人肝癌HepG2细胞株的作用不明显，其原因尚不清楚，这否为癌细胞株和正常细胞株在生长特性上存在差异而带来的结果，则有待于进一步研究证实。但本研究的发现是CNP的促细胞生长和存活作用仅发挥在正常细胞株中。为了进一步观察CNP对细胞超微结构，我们选择了上述实验证明CNP作用的最佳浓度（7.5g/ml）对4种细胞株进行了培养观察。用透射电经观察超微结构结果（见图3、

20、5）显示，添有CNP的细胞未见病理学改变（细胞膜、核膜完整，细胞器、细胞核无损伤、无细胞调亡现象），见有CNP进入细胞并分布于细胞质、线粒体中（见图7、9）。从这些结果可见 CNP能进入细胞内，可促进细胞增殖，而不诱导损伤。 本研究上述结果尽管是初步的，但从CNP应用角度来看，有可能在细胞工程学发挥价值。参考文献1 张阳德，张彦琼，陈记稷等. 壳聚糖-碳纳米粒的制备及其体外性质的研究.中国现代医学杂志J2006,6:13-18.1 ZHANG YD,ZHANG YQ,CHEN JJ. Preparation and in vitro evaluation of chitosan-carbon

21、nanoparticles. HYPERLINK 9/KNS50/Navi/Bridge.aspx?LinkType=BaseLink&DBCode=cjfd&TableName=cjfdbaseinfo&Field=BaseID&Value=ZXDY&NaviLink=%e4%b8%ad%e5%9b%bd%e7%8e%b0%e4%bb%a3%e5%8c%bb%e5%ad%a6%e6%9d%82%e5%bf%97 t _blank China Journal of Modern MedicineJ.2006,6:13-18.2 孙岚，张英鸽.小鼠腹腔注射纳米活性炭体内去向追踪观察.生态毒理学报

22、J2003,17(4):316.2 SNN L, Zhang YG. Tracing of nanoabsorbite with mouse abdominal injection. J HYPERLINK /P-cyyhj.html t _blank Asian Journal of Ecotoxicolog 2003, 17(4):316. 3 Balasubramanian, K., Burghard, M. Chemically functonalized carbon nanotubes. Small 1 (2005), 180192. 4 LI D, HE XX, WANG XM

23、et al. Toxicity of inorganic silicon nanoparticles to cells. Journal of Hunan University 2002, 2(9）：1-6. 5 HYPERLINK /EJ/search_author?query2=B%20J%20Panessa%2dWarren&searchfield2=authors&journaltype=all&datetype=all&sort=date_cover&submit=1 o Find more articles by this author B J Panessa-Warren, HYPERLINK /EJ/search_author?query2=J%20B%20Warren&searchfield2=authors&journaltype=all&datetype=all&sort=date_cover&submit=1 o Find more articles by this author J B Warren, HYPERLINK /EJ/search_author?query2=S%20S%20Wong&searchfield2=author