微生物的检验与检测

1、.微生物实验报告 微生物的检验与检测：.；第 PAGE 8 页 共 NUMPAGES 8 页微生物的检验与检测*生命科学学院 09级生物工程班【摘要】水的微生物学检验，特别是肠道细菌的检验，对保证饮用程度安和控制传染病有着重要意义，同时也是评价水质情况的重要目的。国家饮用水规范规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超越3个，细菌总数每毫升不超越100个。水的微生物检查通常包括两个工程：细菌总数和大肠菌群测定。所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上构成的菌落(colony-formingunit，CFU)数，故其单位应是cfu/g(mL)。

2、它反映的是检样中活菌的数量。所谓大肠菌群，是指在3724h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。【关键词】细菌 大肠菌群 微生物检验 微生物检测大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是卫生领域用语。大肠菌群包括了大肠艾希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研讨阐明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要缘由。粪便中多以典型大肠杆

3、菌为主，而外界环境中那么以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染目的菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，阐明了粪便污染的程度，也反映了对人体安康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有安康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除普通正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在如沙门氏菌、志贺氏菌等，因此食品中有粪便污染，那么可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的能够性，埋伏着食物中毒和流行病的要挟，必需看作对人体安康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要目的之一，目前已被国内外广泛运用于食品卫生任务中。1 资料和方法1.1 资

4、料1.1.1 培育基：牛肉膏蛋白胨固体培育基琼脂为1.5%；乳糖蛋白胨培育液(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏3，乳糖 5，氯化钠 5，溴甲酚紫 0.016，pH 7.3伊红美蓝培育基(g/L)：蛋白胨 10，乳糖 10，磷酸氢二钾 2，2%伊红水溶液 20ml，0.5 %美蓝水溶液 13ml ，琼脂 20，pH 7.21.1.2 实验用品：水样采集器灭菌处置，Eppendorf离心管，Tips，微量加样枪，无菌水，250ml三角瓶灭菌处置，灭菌培育皿1.1.3 规范菌株：规范大肠埃希氏菌与沙门氏杆菌斜面培育物，经实验十一鉴定为大肠菌群的斜面培育物1.1.4 抗血清：兔抗沙门氏菌、大肠埃希氏菌菌

5、体的抗血清(委托公司制备)1.2 水样采集1.2.1 采月湖水的采集：用ETC-1A采水器采集0.5-1米水深样品，然后置于灭菌三角瓶待分析。1.2.2 采集疑似大肠菌群较多的水源，方法同上。(南京外国语学校仙林分校北门口河水)1.3 样品处置1.3.1 池水的稀释：在灭菌离心管中取100L池水加900 L无菌水，混匀，制备10-1的稀释液。原液和10-1的稀释液用于平板计数。1.3.2 根据南京外国语学校仙林分校北门口河水水样的污染程度将水样稀释成10-1、10-2稀释度。1.3.3 抗体的制备：选择安康的兔子作为抗血清制备动物。注射灭活的抗原菌液浓度约为109/mL，第1次耳缘静脉注射0.

6、2 mL，以后每隔2d注射1次，抗原注射量依次为0.4 、0.6、1、2 和2mL等。取血，分别血清，测其凝集效价。假设效价符合要求后，取兔血，待血凝后，离心分别出血清，装入灭菌的血清瓶中并参与0. 01%硫柳汞防腐剂，-20度保管，备用。1.4 样品的平板操作1.4.1 池水样(每组5块平板) 取原液和10-1稀释度的水样各1ml放入培育皿内，倾注15mL融化后冷却的牛肉膏蛋白胨培育基，立刻在桌面作平面旋摇。留意样品与培育基混合时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转，使其充分混匀。旋转时小心，不要使混合物溅到皿边上方。每个稀释度做2个平皿，然后置于37倒置培育。另取一无菌

7、培育皿，倾注15mL牛肉膏蛋白胨培育基作为整个检测实验的空白对照。1.5 大肠菌群的检测多管发酵法1.5.1 初发酵检测乳糖蛋白胨液体培育基 1.5.2 平板分别将24h培育产酸产气的发酵管内的培育物分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，37培育18-24h，将符合以下特征的菌落的一小部分进展涂片作革兰氏染色并镜检。深紫黑色、有金属光泽；紫黑色、不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深。 伊红和美蓝可抑制G+生长；不发酵乳糖的细菌菌落无色透明；能发酵乳糖，产酸力弱，菌落为棕色；发酵乳酸，产酸才干强，菌落紫色，有绿色金属闪光。1.5.3 革兰氏染色察看将阳性结果的菌落取部分涂片，进展革兰氏染色，察

8、看结果。阳性结果的规范：革兰氏阴性，且无芽孢。1.5.4 复发酵确认将革兰氏阴性无芽孢的菌落接种于乳糖蛋白胨液体培育基中，每管可接种同一初发酵管的同类型菌落12个，37度培育24小时，察看结果。 阳性结果的规范：发酵液变为黄色 杜氏小管内有气泡1.6 大肠杆菌和沙门氏菌的血清学检验1.6.1 菌悬液的制备在离心管中参与100l生理盐水。用接种环刮取平板上的菌苔于离心管中。用枪头反复吹吸，使菌液混匀。1.6.2 大肠杆菌、沙门氏菌抗原性检测事先将干净载玻片做上标志，取10倍稀释的大肠杆菌抗血清和沙门氏菌抗血清，各40L于载玻片上。然后，分别参与大肠杆菌和沙门氏菌的菌悬液各40 L。放置于空培育皿

9、中，于37度保温15-20min。温育后，检查能否有颗粒状沉淀。实验表示图：2 结果2.1 菌落计数菌落计数以菌落构成单位colony-forming units, CFU)计数。2.1.1 平皿菌落数的选择：先计算一样稀释度的平均菌落数。假设其中一个平板有较大片状菌苔生长时，那么不宜采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。假设片状菌苔的面积大小缺乏平板的一半，而其他的一半平板菌落分布又比较均匀，那么可将此一半的菌落数乘以2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。2.1.2 稀释度的选择2.1.3 菌落数的报告菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用

10、二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以4舍5入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示见表中报告方式栏 *假设空白对照上有菌落生长，那么此次检测结果无效。附：稀释度选择和菌落报告数方式平板菌落分布图菌落总数统计表水样不同稀释度的平均菌落数菌落总数CFU/mL报告方式CFU/mL未稀释10-1采月湖湖水62(63，60)7(6，8)6262结论：采月湖水符合国家水源规范2.2 查表计数根据三个梯度即三个取水样的体积每5管中出现阳性结果的管数，查阅 总大肠菌群MPNMost Probable Number检索表，得到大肠菌群5次反复测试统计表的细菌最能够数，再乘以相应稀释倍数，

11、即可换算为100mL水样中的大肠菌群数。附：MPN计数法最大能够数(most probable number，MPN)计数又称稀释培育计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。 MPN计数是将待测样品作一系列稀释，不断稀释到将少量如lm1的稀释液接种到新颖培育基中没有或极少出现生长繁衍。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大能够数实际，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。 本次实验的检测数据每升水样中大肠菌群数量取水样的体积mL原液1mL/管10-1稀释度1mL/管10-2稀释度1mL/管管数5管5管5管阳性管数5管5管5管菌数近似

12、值16000 饮用水、水源水、游泳池水卫生的国家规范饮 用 水 1L水不得超越3个 预备加氯消毒后供饮用的水(水源水) 1000预备净化处置及加氯消毒后供饮用的水(水源水) 10000游泳池水 100结论：南京外国语学校仙林分校北门口河水中大肠杆菌群数极多，超越国家水源规范初发酵检测结果 复发酵检测结果划线平板分别 革兰氏染色2.3 大肠杆菌和沙门氏菌的血清学检验抗原性检测结果3 讨论3.1 MPN检索表：MPN 为最大能够数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进展延续系列进展稀释，参与培育基进展培育，从规定的反响呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近

13、似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，那么表内数字应相应降低或添加10倍。留意国家规范和行业规范中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不一样。3.2初发酵和证明实验：无论是国家规范的三步法还是行业规范的两步法，都利用了乳糖发酵管进展了两次发酵实验，培育基的配制略有不同，但都是为了证明培育物能否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气。初发酵阳性管，不能一定就是大肠菌群细菌，经过证明实验后，有时能够成为阴性。有数听阐明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证明实验相差较大。因此，在实践检测任务中，证明实验是必需的。3.3挑选菌落：国家规范中，需求对初发酵阳性培育物接种伊红美蓝平板分别，对典型和可疑菌落进展察看和证明实验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形状等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率亲密相关。国家规范方法规定伊红美蓝平板为分别培育基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有亲密关系，只挑取一个菌