胶质瘤侵袭性生长与基质金属

1、胶质瘤侵袭性生长与基质金属蛋白酶-2及其抑制物关系的研究李 蕴 潜指导教师 索敬贤 教授 王长坤 教授吉林大学第一医院神经外科学前 言大量研究表明，尽管近年来胶质瘤的治疗技术不断提高，但并未从根本上显著改善患者总的预后，其中一个重要原因是胶质瘤的侵袭性生长给手术彻底切除带来许多困难。肿瘤侵袭生长是指瘤细胞突破基底膜和细胞外基质（ECM）构成的组织学屏障，侵犯到邻近的正常组织，并在该处继续生长、增殖的过程。基底膜和ECM降解是肿瘤侵袭的关键，能降解ECM的蛋白酶有多种。其中基质金属蛋白酶类（MMPs）是与肿瘤的侵袭生长关系十分密切的蛋白水解酶。体内MMPs的表达和活性有多种调节方式，包括转录水平

2、调节、酶原的活化、特异性组织抑制因子的调节等。其中金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs）是MMPs的特异性抑制物。已有研究证明，MMP-2和MMP-9是降解ECM成分的重要蛋白酶。在乳腺癌、食道癌、肺癌等多种癌组织均有这两种酶表达和活性增加；肿瘤的恶性程度与MMP-2、MMP-9表达水平呈正相关；MMP-2TIMP-2的比值可决定肿瘤恶性程度及预后。这些研究均证明，肿瘤细胞的侵袭能力与MMP-2、MMP-9及TIMP-2的表达和活性有密切联系，其中与MMP-2和TIMP-2的关系更为重要。然而，与上述肿瘤的研究相比，胶质瘤的侵袭能力与MMPs和TIMPs之间关系的研究很少。有初步研究表明，MMP-

3、2、MMP-9和MT-MMPs与胶质瘤侵袭性的关系更密切，可能是胶质瘤细胞侵袭能力的重要因素。但有关MMP-2和TIMP-2之间的平衡与胶质瘤侵袭性生长的关系尚未阐明，深入的研究很少。本研究利用临床材料和实验材料进行下述5个方面的研究：通过这些人体和实验材料的研究，目的是探讨胶质瘤侵袭性生长行为与MMP-2、TIMP-2表达以及活性的关系，为从抑制MMP活性的角度阻止胶质瘤的侵袭性提供科学依据。实验一胶质瘤基质金属蛋白酶-2及其抑制物-2蛋白表达的研究材料来源：收集1999年至2001年本院神经外科手术切除并经病理确诊的胶质瘤标本35例，男性15例，女性20例，平均年龄40.3岁（1077岁）

4、。患者术前未使用过抗癌药物。按Kernohan标准进行分级：级7例，级12例，级10例，级6例。另取2例正常脑组织作为对照。免疫组织化学染色方法和结果判定：用LSAB法进行人胶质瘤组织MMP-2、TIMP-2和Ki-67的免疫组化染色。MMP-2和TIMP-2表达的判定以染色强度和阳性细胞的百分率之和（分值）进行评价。Ki-67表达是在网格测试板进行计数，然后计算出Ki-67标记指数（LI）结 果一、MMP-2的表达MMP-2阳性染色位于瘤细胞的胞浆。表达MMP-2的阳性细胞多呈散在分布，但一些病例在肿瘤侵润的边缘常常相对集中。随着胶质瘤恶性程度的增加，MMP-2蛋白表达阳性的细胞数逐渐增多，

5、染色强度逐渐增强，表达强度也逐渐增加（附图14），其中以级胶质瘤MMP-2蛋白表达最高。各组间的阳性表达率和表达强度比较均有显著性意义（表3）。（附图14） 表3 胶质瘤MMP-2阳性细胞表达率及表达强度（xs）级 别 例 数 阳性表达（%） 表达强度（分值） 7 10.423.95 2.140.38 12 29.927.69a 3.170.71 a 10 45.409.01ab 4.000.70 ab 6 57.1711.39abc 5.830.41 abc a: 与级比较, p0.05; b: 与级比较，p0.05; c: 与级比较, p0.05二、TIMP-2的表达TIMP-2阳性染色位

6、于瘤细胞的胞浆中。阳性细胞多呈散在性分布。TIMP-2免疫组化显示的情况与MMP-2相反，即随着胶质瘤恶性程度的增加，TIMP-2蛋白表达阳性的细胞数逐渐减少，表达强度也逐渐下降，以级胶质瘤TIMP-2蛋白表达最高，级表达最低（附图58）。同时，随着胶质瘤恶性程度的增加，MMP-2TIMP-2的比值也明显升高，各组间比较有统计学意义（见表4）。（附图58）表4 胶质瘤TIMP-2阳性细胞表达率、表达强度及MMP-2/TIMP-2分值的比值（xs）级 别 例 数 阳性表达（%） 表达强度（分值） MMP-2/TIMP-2 7 51.8112.28 5.570.53 0.370.11 12 36.

7、429.68a 3.920.29a 0.820.23 a 10 22.107.71ab 2.700.50ab 1.520.32 ab 6 4.331.63abc 2.170.41abc 2.920.20 abc a: 与级比较, p0.05; b: 与级比较，p0.05; c: 与级比较, p0.05相关分析显示，在各级别的胶质瘤中，MMP-2与TIMP-2的表达强度见图9，它们之间呈明显负相关（r=0.69，p0.05）。图9位置（柱图）三、Ki-67表达和Ki-67标记指数（LI）Ki-67阳性表达呈棕黄色颗粒状，定位于细胞核。随着肿瘤恶性程度的增高，Ki-67阳性表达的瘤细胞数逐渐增加（

8、附图1013）。各级别胶质瘤Ki-67阳性表达瘤细胞数的百分数（Ki-67标记指数，LI）之间有统计学意义（p0.05）（表5）。（附图1013） 表5 各级别胶质瘤Ki-67标记指数（xs） 级 别 例 数 标记指数（%） 7 8.571.81 12 15.333.80a 10 27.105.20ab 6 44.178.82abca: 与级比较, p0.05; b: 与级比较，p0.05; c: 与级比较, p0.05实验二人胶质瘤基质金属蛋白酶-2及其抑制物-2基因表达的研究材料来源：收集1999年至2001年本院手术切除的胶质瘤标本25例，男性13例，女性12例，平均年龄50.3岁（31

9、67岁）。患者术前未使用过抗癌药物。按Kernohan标准进行分级：级6例；级8例；级6例；级5例。手术中无菌条件下切取少量脑胶质瘤的实质部分，迅速置于液氮中冷冻。另取2例正常脑组织作为对照。方法：用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）的方法检测各组病例脑组织的MMP-2和TIMP-2 mRNA表达水平（具体步骤和cDNA引物从略）。利用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片断（MMP-2、TIMP-2和-actin）进行密度扫描，以-actin密度作为参考定量标准，MMP-2及TIMP-2和-actin密度比值作为定量结果。结 果正常脑组织MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达水

10、平均较低。在各级别胶质瘤中均有MMP-2 mRNA表达，但表达水平与其级别有关，恶性程度越高，其表达水平越高。在各级别胶质瘤中TIMP-2 mRNA均有表达，级别低的胶质瘤TIMP-2 mRNA表达较高，而恶性程度高者TIMP-2 mRNA表达水平反而降低。各组之间MMP-2/TIMP-2基因表达的比值具有显著意义。图14：MMP-2 mRNA电泳图图15：TIMP-2 mRNA电泳图表6 胶质瘤MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达及二者比值(xs)级 别 例 数 MMP-2 TIMP-2 MMP-2/ TIMP-2 6 0.490.06 1.950.22 0.230.02 8 0.750

11、.07a 1.310.14a 0.570.04 a 6 1.210.12ab 0.690.05ab 1.750.18 ab 5 1.660.21abc 0.380.02abc 4.370.79 abca: 与级比较, p0.05; b: 与级比较，p0.05; c: 与级比较, p0.05实验三胶质瘤基质金属蛋白酶-2及其抑制物-2活性的研究胶质瘤标本来源、病理确诊、分级标准、标本切除、处理方法及对照标本均同实验二。用酶谱法和反向酶谱法分别检测MMP-2和TIMP-2活性。对电泳条带进行灰度扫描，用酶解量表示酶的活性：条带的酶解量=条带面积（条带灰度背景灰度），每个样品设两个平行样本，并经3次

12、重复实验，每次实验均设同一参照。结 果用酶谱法检测MMPs活性，结果表现为在蓝色凝胶背景上出现无色透明条带。本实验在凝胶上的透明条带分子量分别为62kD，根据分子量及底物（明胶）特异性，62kD为MMP-2的活化形式。随着肿瘤恶性程度的增加，MMP-2活性也明显增加，而TIMP-2的活性则与MMP-2相反，即随着肿瘤恶性程度的增加，TIMP-2活性明显降低。 表7 不同级别胶质瘤MMP-2和TIMP-2活性（xs） 级 别 例 数 MMP-2活性 TIMP-2活性 3 1.660.59 3.451.58 4 2.150.68a 2.291.14a 3 3.211.21ab 1.180.35ab

13、 3 4.111.65abc 0.680.12abc a: 与级比较, p0.05; b: 与级比较，p0.05; c: 与级比较, p0.05图16柱图图17酶谱图（兰色）实验四胶质瘤细胞株体外侵袭能力的研究突破基底膜屏障是肿瘤侵袭周围正常组织的启始步骤和重要环节。本实验的基本原理是：将含有基质成分的Matrigel基底膜胶铺在多微孔的滤膜上，使在体外形成人工基底膜。在膜的下室加入趋化因子，加入到上室腔的肿瘤细胞，受到滤膜下面趋化因子的趋化作用而向下运动，当分泌的蛋白酶降解了覆盖膜孔的Matrigel后，才能运动到膜的下室面。计数膜下室面的细胞可定量反映肿瘤细胞的侵袭能力。材料与方法一、材料

14、：1Boyden小室，由多伦多大学Kalinski教授惠赠；2聚碳酸酯多孔滤膜（PVPF滤膜），孔径8m；3Matrigel基底膜胶，主要为基底膜成分；抗MMP-2抗体，博士德公司产品。NIH 3T3细胞和U87MG恶性胶质瘤细胞株，由多伦多大学Kalinski教授惠赠。二、方法：用NIH 3T3细胞制备含趋化因子的条件培养液，作为趋化因子的来源。在PVPF滤膜上室面铺Matrigel胶。在小室的下室腔加上述含趋化因子的培养液和DMEM培养液。将PVPF滤膜置于下室腔的培养液上，旋紧顶盖以固定滤膜。在小室的上室腔内分别加入保温1h的U87MG恶性胶质瘤细胞（2105）、U87MG胶质瘤细胞+抗

15、MMP-2抗体（对抗MMP-2）及U87MG胶质瘤细胞+EDTA（抑制MMP-2活性）。每组设3个平行样本。将侵袭小室置于CO2培养箱内孵育6h后终止孵育。用棉签彻底擦去滤膜上室面的细胞，拧下顶盖，取出滤膜，甲醇固定，HE染色，封固。将滤膜人为分为相等的9个区，每个滤膜在400倍光镜下计数除四角以外的5个区的肿瘤细胞数，计算平均值。结 果表8 恶性胶质瘤细胞体外穿膜的细胞数（xs） 分 组 孵育时间（h） 穿膜细胞数 抑制率（%） U87MG 6 23172 U87MG+EDTA 6 4817a 381.0 U87MG+MMP-2抗体 6 5320a 335.8 a: 与U87MG组比较，p0

16、.01图18柱图实验五胶质瘤细胞株对胶原降解能力的研究材料与方法一、材料：型胶原酶、明胶（gelatin）、纤维蛋白溶酶和琼脂糖等二、方法：将U25MG胶质瘤细胞在DMEM培养液培养3d后，收集该胶质瘤条件培养液，浓缩，-80保存备用。配制2%琼脂糖溶液。将琼脂糖和明胶溶液以1:1的比例混合，将混合液加至培养皿，凝固后，用打孔器打孔，孔间距离1.5cm以上。将胶质瘤细胞条件培养液加入不同孔中，每孔加20l。同时每孔加入一定量纤维蛋白溶酶（刺激酶原形式MMP活化）。培养板皿在37温育24h。设单独加抗MMP-2抗体及单独加EDTA阴性对照孔和胶原酶阳性对照孔。每个条件设3个复孔。温育后取出凝胶片

17、，用考马斯亮蓝R 250溶液室温下染色和脱色。分别测量孔周围呈无色透明空斑的面积。结 果表9 胶质瘤细胞对胶原降解能力的研究（xs） 分 组 孵育时间（h） 空斑面积（mm2） 抑制率（%） U87MG 24 107.5521.75 U87MG+EDTA 24 22.514.95 a 377.79 U87MG+MMP-2抗体 24 30.769.88 a 249.64 a: 与U87MG组比较，p0.01讨 论大量研究表明，MMPs的表达和活性与肿瘤的侵袭性生长有关。然而，与其他肿瘤的研究相比，胶质瘤细胞侵袭性行为的分子机制尚不完全清楚，有关MMP-2和TIMP-2之间的平衡及其与胶质瘤侵袭性

18、生长的关系，尚很少报道。因此，研究胶质瘤MMP-2、TIMP-2的表达和分泌规律，明确二者间的关系，对防治胶质瘤侵袭性生长和改善预后具有重要意义。人胶质瘤MMP-2和TIMP-2蛋白和mRNA的表达本研究结果表明，在不同级别的胶质瘤中MMP-2蛋白呈不同程度的表达。胶质瘤的恶性程度越高，免疫组化显示MMP-2阳性表达的细胞数越多，阳性表达细胞的免疫染色也越浓重。本研究发现，在一些级别较高的胶质瘤的边缘可见MMP-2呈高表达，并沿着肿瘤边缘形成带状，提示肿瘤边缘是胶质瘤侵袭、扩展的主要部位，这为胶质瘤的侵袭性生长行为提供了形态学证据。由于胶质瘤边缘区MMP-2的表达增加，肿瘤的ECM，特别是基底

19、膜的主要成分型胶原的降解加速，肿瘤细胞可突破基底膜屏障而向外扩展生长。本研究结果还表明，与MMP-2的表达情况相反，随着胶质瘤恶性程度的增加，TIMP-2的表达逐渐降低，而且TIMP-2的表达与MMP-2的表达呈负相关。而且，随着胶质瘤恶性程度的增加，MMP-2/ TIMP-2蛋白表达的比值逐渐增高。这些结果提示，随着胶质瘤恶性程度的增加，肿瘤细胞分泌的MMP-2增加，而分泌的TIMP-2减少，MMP-2降解ECM的作用增强。在低度恶性胶质瘤中，由于TIMP的表达水平和活性较低，不能完全抑制MMP活性，因此这类肿瘤细胞只表现出较弱的侵袭力。相反，在恶性胶质瘤，MMP的表达和酶活性明显增高，虽然

20、也有TIMP的表达，但尚不足以抑制MMP的活性，因而肿瘤细胞具有较强的侵袭能力。胶质瘤细胞的侵袭性与MMP和TIMP的表达和（或）活性的失平衡有密切关系。本研究发现，MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达规律与其蛋白的表达特点相近，即随着胶质瘤恶性程度的增加，MMP-2 mRNA的表达逐渐增加，而TIMP-2 mRNA的表达则逐渐降低，表明胶质瘤中MMP-2和TIMP-2的改变，不仅发生在蛋白质水平上，而且在基因转录水平就已发生变化。Ki-67作为细胞增殖能力的免疫组化标志物，用以评价肿瘤的增殖状态和恶性行为。Ki-67表达与增殖细胞的增殖周期有关，主要在晚G1、S、G2和M期表达。本研究结

21、果表明，随着胶质瘤恶性程度的增加，Ki-67表达指数（LI）逐渐升高，提示随着胶质瘤恶性程度的增加，其增殖能力和恶性行为增强。二、人胶质瘤MMP-2和TIMP-2的活性我们用酶谱分析（zymography）检测了人胶质瘤MMP-2的活性，其基本原理是，在SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶中均匀混入MMP-2的作用底物明胶，使待测样品在此凝胶中电泳。如果样品中具有MMP-2活性，则能降解明胶，经考马斯亮蓝染色后，在蓝色背景下可显出MMP-2活性存在的无色透明条带。用酶谱分析检测TIMP-2活性的基本原理是，在SDS凝胶中均匀混入明胶，将待测蛋白样品在此凝胶中电泳，并用型胶原酶处理。若样品中存在T

22、IMP-2活性，则能抑制型胶原酶，使明胶被保留下来，经考马斯亮蓝染色后，在白色的背景下可显出TIMP-2存在的蓝色条带。本实验在电泳后观察到，在凝胶上出现的透明条带的分子量分别为62kD，这是MMP-2的活化形式。定量分析表明，各级别胶质瘤均能检测到MMP-2的活性形式（62kD）。本研究证明，随着肿瘤恶性程度的增加，MMP-2活性明显增加。而TIMP-2的活性则正与MMP-2相反，即随着肿瘤恶性程度的增加，TIMP-2活性明显降低。MMP-2和TIMP-2的活性与其mRNA、蛋白的表达情况一致。三、恶性胶质瘤细胞体外侵袭能力和胶原酶活性体外检测肿瘤侵袭能力的方法很多，其中，肿瘤细胞对重组基底

23、膜的侵袭实验是常用方法之一。侵袭实验是将含基底膜成分的Matrigel胶铺在有微孔的滤膜上，使在体外重组形成基底膜。加入到上室腔的肿瘤细胞，受到滤膜下面趋化物质的趋化作用而向下室运动，但只有降解Matrigel膜后，才能运动至膜下室面。计数膜下室面的细胞可定量反映肿瘤细胞的侵袭能力。本研究结果表明，恶性胶质瘤细胞U87MG穿过人工基底膜的细胞数，明显多于加入EDTA或加入抗MMP-2抗体的穿膜细胞数，表明EDTA和MMP-2抗体对U87MG细胞穿膜能力有明显的抑制作用。MMPs的活性依赖于分子中Zn2+的存在，EDTA能络合MMPs分子中的Zn2+，使MMPs丧失酶活性。在本研究中，加EDTA

24、能明显抑制U87MG穿膜能力，表明MMPs在U87MG侵袭能力中起一定作用。但EDTA对MMPs酶活性的抑制作用无特异性，对多种MMPs活性均有抑制效应。在本研究中进一步研究证明，加入抗MMP-2抗体能明显抑制U87MG穿膜能力。抗MMP-2抗体能特异性地与MMP-2结合，使MMP-2失去生物学活性，表明MMP-2对U87MG的侵袭能力有重要影响。在体外观察胶质瘤细胞分泌的MMPs对变性胶原明胶的降解作用，是观察胶质瘤侵袭能力的另一种方法，可根据形成空斑的大小检测胶原酶的活性及胶质瘤的侵袭能力。本研究证明，U25MG胶质瘤细胞条件培养液的孔周形成的透明空斑面积明显大于加入EDTA或加入MMP-2抗体的透明空斑面积，表明EDTA和MMP-2抗体对U87MG的空斑形成有明显的抑制作用。明胶（gelatin）为变性胶原，是型胶原酶（MMP-2，MMP-9）特异性降解底物。在本实验中，培养孔周围形成的透明空斑越大