分子生物学实验

1、.：.；实验操作1. 防止长时间的培育，大肠杆菌普通培育12个小时就可以挑取克隆子进展验证了。主要是由于培育时间过长，尤其是含有Amp抗性的质粒。重组菌可以分泌酶降解Amp，呵斥平板中部分Amp浓度太低。其他未重组菌在Amp存在的情况下只是生长受抑制而非死亡，当Amp浓度降低时就可以生长了。卫星菌落，由于阳性菌落大量分解抗生素，呵斥周围区域抗生素浓度降低，那么无抗性的菌也生长出来了。一句话，他的板子培育时间过长了。这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，就是又抗性的E col分泌beta内酰胺酶分解周围的amp，从而使没有抗性的e coli生长。 2.3. 乙醇可以消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸

2、基团暴显露来。Na之类的平衡离子可以与这些带电基团结合，在沉淀构成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只需在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以恣意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反响，对DNA很平安，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合形状稳定存在，当参与乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。普通实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因此也可改用95乙醇来替代无水乙醇由于无水乙醇的价钱远

3、远比95乙醇昂贵。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因此DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95乙醇替代无水乙酵，最后的沉淀步骤要运用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。普通在室温下放置1530分钟即可。 2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.10.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于相互聚合而构成DNA钠盐沉淀，当参与的盐

4、溶液浓度太低时，只需部分DNA构成DNA钠盐而聚合，这样就呵斥DNA沉淀不完全，当参与的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反响，必需求进展洗涤或重沉淀。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以恣意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反响，对DNA很平安，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合形状稳定存在，当参与乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。普通实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67左右。因此也可改用95乙醇来替代无水乙醇由于无水乙醇的

5、价钱远远比95乙醇昂贵。但是加95的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因此DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95乙醇替代无水乙酵，最后的沉淀步骤要运用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。普通在室温下放置1530分钟即可。1。DNA不溶于乙醇2。乙醇可以吸附水分子极性一样，使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。3。附：乙醇沉淀DNA需求盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才干沉淀完全。4. 溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸

6、的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专注地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的维护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而到达杀菌的作用，这主要是由于革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4键结合的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会遭到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能

7、维护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能经过消化道而坚持其活性形状，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的添加，还可以促进蛋白质的消化吸收5. 酚、氯仿是变性蛋白质的由于苯酚能溶进少量水损失DNA，因此与氯仿一同运用，减少DNA损失异戊醇是消泡剂蛋白量变性中经常产生气泡，会损失DNA，因此需消泡抽提DNA去除蛋白质时，怎样运用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合形状而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因此与水相分别，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与

8、氯仿有机溶剂比重更大，保管在最下层。作为外表变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约1015的水溶解在酚相中，因此损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合运用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一同将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合1:1运用。 10为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必需猛烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻

9、止相互间的充分作用。参与异戊醇能降低分子外表张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。普通采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1不用先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。1.酚/氯仿/异戊醇的作用：从核酸样品中除去蛋白质时经常运用酚和氯仿都能使蛋白量变性，并使其溶于有机相或中间相内，而异戊醇那么有助于消除抽提过程中出现的气泡。6. -巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,防止褐变,使酚容易去除7. 8. 说得对。75%乙醇清洗DNA的目的是脱盐的。其机

10、理如下：75%乙醇中含有25%的水，这部分水可以溶解和DNA沉淀中混有的、DNA沉淀前参与的钾盐或钠盐，但同时也会溶解损失少部分DNA盐离子比DNA更易溶于水中。为了减少DNA损失，所以用含量较高的乙醇溶液DNA不溶于乙醇。蛋白质、糖、脂类等都可以溶于75%酒精，而DNA不溶9.10. RNase A的作用是使RNA降解，减少提获得到的DNA中的RNA，以便减少对后续实验的影响。RNaseH是一种逆转录酶。消化mRNA用的。RNase H，即Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。RNase H不能水解单链或双链

11、DNA或RNA中的磷酸二酯键，即不能消化单链或双链DNA或RNA。 特点：特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA第二链的合成编辑本段用途 在cDNA第二链合成前去除mRNA DNA-RNA杂交体的鉴定 在Oligo(dT) 存在下去除mRNA 的poly(A)尾11. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当参与中和液后，质粒DNA分子可以迅速复性，呈溶解形状，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。0.2 N NaOH：是最正确的溶解细胞的试剂，不论是大肠杆菌还是哺乳动

12、物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer双层膜构造向micelle微囊构造的相变化所导致。由于质粒和细菌染色体的拓扑构造不同，变性时前者虽然两条链分别，却依然缠绕在一同不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂。因此，在裂解细菌时要留意：第一，时间不能过长，由于在这样的碱性条件下DNA片断会渐渐断裂；第二，混合必需轻柔，不然DNA也会断裂。1% SDS十二烷基磺酸钠：是一种阴离子外表活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白量变性。 12. 这一步的K置换了SDS十二烷基磺酸钠中的Na，得到PDS十二烷基磺酸钾沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个S

13、DS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。当参与pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性程度时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链构造，但是主染色体DNA那么难以复性。SDS遇到钾离子后变成十二烷基硫酸钾potassium dodecylsulfate, PDS，而PDS是不溶于水的，而高浓度的盐使得沉淀更完全。SDS极易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。同时，虽然SDS并不与DNA分子结合，由于大肠杆菌的基因组DNA很长，很容

14、易和变性的蛋白质缠绕在一同。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，变性蛋白质等缠绕一同被沉淀，而复性的质粒DNA以可溶性形状留在上清夜中。13. 所谓星活性又称Star活性。是指由于反响条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的景象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。 所以说Star活性与粘端变平端没关系。另外，Star活性除了与酶本身的性质有关外，与甘油浓度，pH值及离子浓度有关。 普通正规厂家消费的限制酶出厂前都做相关的检测，buffer体系也都做了相应的思索。因此正常情况下酶切，可以先不用思索Sta

15、r活性的问题。 一旦出现底物DNA不好切断，需求添加酶量或延伸反响时间时，假设运用的是易产生StaR活性的限制酶切，普通优先思索添加酶量，而不是延伸反响时间，换句话说，延伸时间比添加酶量更易产生Star活性。 另外，实践上几乎一切的限制性内切酶都能够产生Star活性。但目前Star活性对实践实验室操作过程中的影响并不太大，可以先不思索。普通来说，限制性内切存在严厉的识别在序列特异性，但某些条件改动，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在称号右上角加一星号表示。产生星活性的条件甘油浓度离子强度 高盐缓冲液酶降低盐pH值 7

16、.585产生有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)12%(V/V)二价阳离子Mn2+替代Mg2+酶与DNA的比例 酶与DNA比为(50Ug)产生星活性。为了防止星活性的出现，一切限制性内切酶反响在规范条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进展。 某些限制性内叨酶诱导产生星活性的反响条件 酶 诱导星活性条件 AvaI A,B,DEcoRI A,B,D,E,FHae B,DHhaI B,D,GBamHI A,B,C,D,E,H A乙二醇(45)；B.甘油(1120)；C.乙醇(12)；D高酶：DNA比值()25Ug)；EMn2+替代Mg2+；FpH85；GDMSO(8)；H无NaCl14.

17、同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最正确缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最正确NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见及每支酶的阐明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最正确缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此运用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的详细活性相应调整酶量和反响时间。要保证双酶真实验的高效、准确，就要选择适宜的通用buffer。这样就能防止质粒和基因没有切动或者被切散。常用的几家内切酶公司有MBI、 NEB、Promega、Roche、Takara，要

18、查找双酶切体系的通用buffer，最好到出品该内切酶的公司网站上查询。15. 缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持适宜的pH。电泳时正极与负极都会发生电解反响，正极发生的是氧化反响4OH-4e-2H2O+O2)，负极发生的是复原反响4H+4e-2H2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲才干，是溶液两极的pH坚持根本不变。电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，普通电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会呵斥过大的电流使胶发热甚至熔化。电泳缓冲液还有一个组分是E

19、DTA，参与浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。16.17. 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.52之间，低浓度的用来进展大片段核酸的电泳，高浓度的用来进展小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和运用质量好的琼脂糖是处理方法。留意高浓度的胶能够使分子大小相近的DNA带不易分辨，呵斥条带缺失景象。孔径大的琼脂糖。19. 、细胞的生长形状和密度最好从-70或-20甘油保管的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用曾经过多次转接，及储存在4的培育菌液。细胞生长密度以每毫升培育液中的细胞数在5107个左右为佳。即运用

20、对数期或对数生长前期的细菌，可经过测定培育液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为05时，细胞密度在5107个/ml左右。应留意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同。密度过高或缺乏均会使转化率下降。此外，受体细胞普通应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当参与的外源DNA的量过多或体积过大时，那么会使转化率下降。普通地，DNA溶液的体积不应超越感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50

21、ul的感受态细胞到达饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进展转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也亲密相关，环状重组质粒的转化率较分子量一样的线性重组质粒高10100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯真的水配制，最好分装保管于4。、防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进展，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处置。一切的试剂都要灭菌，且留意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否那么均会影响转化效率或杂DNA的转入。、整个

22、操作均需在冰上进展，不能分开冰浴，否那么细胞转化率将会降低。20. TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀TAE与TBE的区别首先要知道 TAE 與 TBE 緩衝溶液的成份如下：50 x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA) 242 gm Tris base 57.1 ml Acetic acid 100ml 0.5M EDTA Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5.10 x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA

23、) 108 gm Tris base 55 gm Boric acid 9.3 gm Na4EDTA Add ddH2O to 1 liter. The pH is 8.3 and requires no adjustment.它們的分別有以下幾點：1. TBE 不能太濃 (它只可有 10 times)，因為 borate 會很容易沉澱，但普通有少許沉澱是不會有太大問題。2. TBE 的 buffering capacity 比 TAE 高，用 TBE 來跑出來的 gel，分辨率 (resolution) 會比較高。3. 因為 TBE 有 borate 離子 (ion)，它會影嚮酵素 (enz

24、yme) 的任务。因此，假设要為分離出的 DNA 進行下一步酵素處理，如 cloning 或 restriction cut 的話，就要切記不要讓 DNA 碰上 borate ion。4. TAE的 buffer capacity 比較差，gel 普通比較模糊，但它不會對影嚮酵素三种缓冲液的配制方法Tris-乙酸TAE：50浓储存液每升：242g Tris 碱57.1ml 冰乙酸100ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)运用时再稀释50倍。Tris-磷酸TPE：10浓储存液每升：108g Tris 碱15.5ml 85磷酸1.679g /ml40ml 0.5mmol/L EDTA(

25、pH8.0)运用时再稀释10倍。Tris-硼酸TBE：5浓储存液每升：54g Tris 碱27.5g 硼酸20ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)21. 规范的PCR反响体系：10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L 800ul引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ulPCR反响五要素： 参与PCR反响的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+22. 1、思索能否引物有问题，不特异；2、能否Taq酶加多了，普通50ul体系加1U Taq就可以了；3、能

26、否是Mg2加多了，Mg2加多了会呵斥非特异扩增；4、能否退火温度不好？5、能否循环数过多，PCR扩增后期，进入平台期扩增，错误扩增添加，非特异性也加强.23. 能够有如下缘由:1, 模板量过低;2, 引物浓度多大;3, 退火时间过长.4, 最重要的一点是,在引物设计过程中防止引物间有互补序列,尤其是3末端, 并且尽量使引物3末端的GC含量高一点,使与模板严密结合.做到以上各点,普通不会出现引物二聚体了.24. 由于RNase能迅速降解RNA，且耐热、耐酸、耐碱，不需求辅助因子，用蛋白量变性剂只能使之暂时失活，变性剂去除后，其活性又可恢复。因此，分别提取RNA时，为确保RNA的完好性，必需发明一

27、个无RNase的环境，操作时应特别留意以下几个方面：1操作者在整个实验过程中必需戴消毒手套和口罩，并经常改换。2玻璃器皿冲洗干净后，需180250干烤4小时以上。3尽能够运用一次性塑料制品(Ep管、吸头等)，用0.1%DEPC溶液浸泡过夜，80烤干后高压灭菌。4电泳槽冲洗干净后，于3%H2O2中浸泡30分钟以上，然后用0.1%DEPC溶液或高压灭菌水彻底冲洗。5除Tris类试剂外，一切溶液用0.1%DEPC处置12小时以上，然后高压消毒。所用试剂应未开封或RNA公用试剂。6运用剧烈、有效的RNase抑制剂以抑制内源RNase。常用的RNase抑制剂有异硫氰酸胍GTC、氧钒核糖核苷复合物VRC、

28、RNasin及焦碳酸二乙酯DEPC等。评价RNA质量的规范是RNA的均一性和完好性。均一的RNA取决于有效的去除RNA提取物中的DNA、蛋白质和其他杂质；完好的RNA那么取决于最大限制地防止纯化过程中内源性及外源性RNase对RNA的降解。通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA 的A260/A280=2.0，但由于所用的标本不同，此比值有一定的变化，普通在1.72.0之间，低于该值阐明有蛋白污染，需进一步用酚/氯仿抽提。有时样本的A260/A280能够大于2.0，如反复读数无误，并不表示纯度有问题。RNA的完好性可经过琼脂糖电泳法进展鉴定。完好的RNA电泳时，28S约4.8Kb

29、和18S约1.9KbrRNA经EB染色后，两条电泳条带的显色强度近似为2比1。25. RNA提取提取RNA可以分为总RNA，mRNA，Virus RNARNA病毒几类Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法，这种方法的原理是：首先用强变性剂异硫氰酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和水相，从而使DNA和RNA别分开来。进一步经过有机溶剂来抽提沉淀RNA，就可以得到纯真的RNA；26.27. 一、 防止RNA酶污染的措施1. 一切的玻璃器皿均应在运用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可

30、用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗留意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能运用。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇枯燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽能够的用0.1% DEPC，在37处置12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，该当用DEPC处置过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作公用实验室，一切器械等应为公用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯DEPC：是一种剧烈但

31、不彻底的RNA酶抑制剂。它经过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白量变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被以为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞构造使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有剧烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷构成的复合物，它和RNA酶结合构成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂RNasin：从大鼠肝或人胎盘中提获得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制

32、造用。28.29。配1000ml的DEPC处置水，加1mlDEPC。 磁力搅拌器搅拌 过夜 。第二天 高压蒸汽灭菌 121c，25min DEPC分解成二氧化碳和酒精，封锁冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量防止污染。DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处置过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。经检测不含RNase、DNase和proteinase。 DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反响体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反响体系。 DEPC水普通是指千分之一浓度的DEPC,

33、在搅拌器上搅拌至完全溶解，即看不到“油珠为止，用来处置枪头、EP管的DEPC水不需高压灭活，而用于配制DEPC酒精等试剂和用来这种RNA相关实验的DEPC水需灭火后运用。 DEPC气味芳香浓郁，强挥发性，有毒，需在通风橱中操作。 方法是：取市售DEPC 1ml，参与1L待处置水蒸馏水等中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPCDEPC分解为CO2和乙醇。有些试剂 可直接参与DEPC，终浓度普通为0.1%0.4%，原那么上在杂交及其以前的步骤中，一切液体试剂均需用DEPC处置，或用DEPC水配制，包括乙醇的 稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤

34、。 留意：DEPC是 潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进展，并防止接触皮肤。含有Tris缓冲液的溶液中，不能参与DEPC。 去离子纯真水参与DEPC达浓度0.1%，室温下继续搅拌过夜，分瓶包装后湿热高压灭菌彻底挥发去除DEPC后可以长期保管在室温或4度冰箱，不宜反复运用。30.31. 非变性凝胶里面没加变性剂，普通是SDS。非变性胶跑出来的蛋白能坚持其活性普通用做功能实验，如EMSA。由于没有变性剂的缘由非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的影响，因此对蛋白等电点确实定和缓冲液的酸碱性有留意，有时需求倒转电泳时的正负极。从跑的胶来看，变性胶会比较美观，带比较窄，非变性胶跑

35、出来那么比较粗糙。32. 140ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60，加7ml10MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。 2等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1MSE缓冲液的电泳槽。 3使RNA变性最多20g，RNA4.5ml,10MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。 455加热15min，冰浴冷却。 5加2ml5载样缓冲液。 6上样、同时加RNA标志物同位素32PdCTP。 760伏电泳过夜。 8取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。 9室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解

36、高分子RNA，以加强转印。 10室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。 1120SSC洗胶1h。 1220SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 13取出硝酸纤维素膜，80真空烘烤2h。 本卷须知1严厉遵守实验规那么，物必准确。2由于好多药品是有毒的，对人体有害，请留意本身平安，做好防护。33. 要进展北方杂合反响前，必需先将RNA自洋菜胶体转移至硝化纤维纸nitrocellulose membrane 或尼龙膜 nylon membrane 上，这一个过程称为转印 blotting。 普通常用的方法包括毛细管转移法 capillary transfer、真空转移法 vacuum transfer 与电转印法 electroblotting。 毛细管转移法借助吸水纸吸收转移缓冲液时所产生的牵引力量将RNA自洋菜胶体转移至膜上；要转印完全，起码需求作用6 h以上。 虽然所需破费的时间比较长，以其不需求特别的仪器设备，毛细管转移法目前仍被普遍采用。 假设分析RNA时采用变性聚丙烯酰胺胶体电泳，那么必需以电转印法进展RNA转印。至于膜的选择，硝基纤维素膜的优点是比较不会产生非专注性反响；不过其一旦被润湿再烘干的后，容易碎裂，不适用于进展多次杂合反响。 尼龙膜的优点是韧性好，与核酸结合的才