龋病微生物学

1、龋病微生物学（Microbiology of dental caries）龋病（dental caries）是以细菌为病原体，多种因素参与，发生在牙齿硬组织的慢性、进行性、破坏性疾病。从龋病的概念中我们可以看出龋病与微生物的关系密切，没有微生物的参与牙齿不能形成龋样破坏。多年的研究表明：龋的发生离不开菌斑生物膜的环境，这其中牙冠部龋和根面龋关系密切的微生物是变异链球菌群中的变异链球菌和远缘链球菌，其次是乳杆菌属。 致龋微生物特点（Properties of cariogenic microorganisms）根据Robert-Koch发现病原菌原则： 1.必须有规则的从可疑病例中发现并分离同一

2、种病原体； 2.该病原体能在体外培养并传代； 3.培养出的病原体能使易感动物发病；4.并从发病的动物分离培养出该病原体。Clarke于1924年成功分离出变形链球菌，确认变链是龋病的病原菌。现在的对于致龋菌的结论是：是否具有致龋的毒力因子，包括：对牙面的粘附性、产酸、耐酸，合成胞内外多糖的能力；是否在实验动物中致龋；流行病学调查是否证明该中细菌与龋的发生关系密切。相关性包括：龋病发生、发展全过程中均存在； 在开始脱矿的牙面其数量明显增多； 能从龋的各个阶段获得分离培养； 在无龋牙面以及无龋者唾液中含量很低。致龋微生物特性描述：能够粘附定居牙面致龋的先决条件；细菌通过钙桥、氢键和疏水作用可逆性吸

3、附牙面；粘附素与受体的特异结合使细菌牢固粘附，以牙菌斑生物膜的形式抵抗食物的咀嚼和唾液机械冲洗的影响，为致龋创造条件。能迅速将糖转运入细胞，代谢糖产酸变异链球菌拥有两套转移糖进入细胞系统：磷酸转移酶系统（phosphotransferase system，PTS）：与葡萄糖亲和力高，在低糖浓度、高pH时，活性大；（淀粉类食物短缺）透性酶系统（permease system）：与葡萄糖亲和力低，高糖浓度、低pH时，活性大。（淀粉类食物丰富） 相互弥补的两套系统保证变异链球菌在不同环境中都能迅速摄取外界的糖，用于生长。转移进入细胞内的糖成分经固有糖分解途径生成丙酮酸，经无氧酵解产生有机酸。菌斑内微

4、生物可以生成多种有机酸：乳酸、甲酸、丙酸、丁酸和琥珀酸。链球菌是产酸量最大，数量最多。变异链球菌能发酵多种糖产酸，产酸速度也最快。酸的种类影响龋病的发生。低pH值、低pK值的酸性产物和龋成正相关。各种有机酸的pH和pK值表具有耐酸性耐酸性（acid tolerance）是指细菌在酸性环境中生长和代谢的能力。在酸性环境中生长，表明能进一步代谢碳水化合物产酸，进一步降低pH。 表能否合成细胞内和细胞外多糖细胞外多糖包括：葡聚糖、果聚糖和杂聚糖，其作用是参与菌斑基质建设，促进菌斑形成，有助于龋环境建立。菌斑基质成分中1/3是细胞外多糖成分，葡聚糖占95%，果聚糖占1%。葡聚糖分为水溶性和水不溶性葡聚

5、糖；能合成水不溶性葡聚糖的变链菌株致龋力强；龋损表面菌斑基质中含有更多的水不溶性葡聚糖；由于这些成分的改变导致菌斑中钙、磷、氟浓度降低；空隙的增多导致大分子及带电物质（如唾液中缓冲物质）不能进入菌斑深层中和酸性或其他代谢产物；一些小分子糖和非带电颗粒容易进入，维持深层微生物生存条件，产酸致龋。水溶性葡聚糖、果聚糖和杂聚糖是细胞外能量贮备形式，当外源性糖短缺时，这些能源储备的水溶性多糖可降解为单糖，参与细菌代谢产酸。菌斑内部分微生物，如变链、乳酸和放线菌等在外源性糖供应充足时，能利用这些糖合成以糖原和支链淀粉形式的胞内多糖，作为胞内储能形式，一旦外源性糖短缺，可以利用胞内多糖作为能量来源，同时产

6、酸，降低pH。实验证明：产胞内多糖的链球菌：位于菌斑深层、龋活性区域、致龋毒力强。致龋微生物种类、致龋性链球菌及其致龋特性链球菌（Strepcococcus）是口腔中正常菌群，所占比例最大，接近50%，口腔中产酸最多的微生物。包括：变异链球菌群（mutans streptococci或Streptococcus mutans-group）、唾液链球菌群（Streptococcus salivarius-group） 、咽峡炎链球菌群（Sterptococcus anginosus-group）和轻缓链球菌群（Streptococcus mitis-group）变异链球菌群是一群表型特征相似，但

7、血清型、遗传型各异的链球菌，因在不同培养基生长时形态变异得名，包括：（表）变异链球菌、远缘链球菌与人类龋病的发生关系密切。变异链球菌的检出率高于远缘链球菌；有变异未必有远缘，有远缘常常可检出变链；口腔中二者同时检出其患龋程度严重。远缘产酸速度和产乳酸量大于变链；耐酸强于变链；能合成水不溶性葡聚糖，不合成胞内多糖。感染性疾病，窗口期，变链数量流行病学（表）变异链球菌致龋特性表现为牙面定植；产酸和耐酸，发酵多种糖产酸，主要产物是乳酸，产酸力强，迅速，耐酸，耐酸力第二，合成胞外、胞内多糖多糖。粘附能力变链对牙面有高亲和力，对牙面的粘附包括蔗糖非依赖性粘附（sucrose-independent ad

8、hesion）和蔗糖依赖性粘附（sucrose-dependent adhesion）。蔗糖非依赖性粘附：是指变异链球菌通过表面的粘附素与牙面获得性膜中的受体特异结合，使得细菌对牙面的粘附；粘附素包括表面蛋白和壁相关蛋白A（WapA）；参与变链粘附的受体来自唾液，包括：粘蛋白、淀粉酶、富脯蛋白；变链对牙面获得性膜的粘附是粘附素和受体共同作用的结果。表面蛋白表面蛋白是变异链球菌的主要粘附素，主要毒力因子之一；存在于除b血清型外的所有变异链球菌细胞膜表面；多种命名，混乱：AgI/II、P1、Pac、SpaP、Sr、AgB和IF；远缘表面蛋白命名为：SpaA、PAg；二者高度同源。结构：图一个信号肽

9、区域；两个保守区域A区和P区，之间是可变区域；SBR是唾液糖蛋白结合区，P区附近是另一粘附区；粘附区是疫苗选择的好点。表面蛋白粘附区和获得性膜中受体以共价键方式结合，定植于牙表面；也可在释放酶作用下脱离细胞壁与受体结合，抑制细菌粘附。壁相关蛋白WapA参与对牙面的附着；也被称为AgA或AgIII蔗糖依赖性粘附蔗糖存在蔗糖为底物，在酶作用下形成葡聚糖，带负电荷的葡聚糖粘附到牙面或获得性膜；变链表面葡聚糖酶受体与葡聚糖结合，完成粘附；受体是葡糖基转移酶（GTF）和葡聚糖结合蛋白（glucan-banding proteins，Gbps），葡糖基转移酶具有活性，利用蔗糖为底物，合成葡聚糖；细菌表面葡

10、聚糖受体与之结合粘附牙面葡聚糖结合蛋白是指有葡聚糖结合活性，无葡糖基转移酶活性的蛋白质；有四种Gbps：GbpA、GbpB、GbpC和GbpD；GbpA、GbpD与GTF粘附序列高度同源。产酸变异链球菌能发酵蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蜜二塘、棉子糖、麦芽糖等多种糖产酸，产酸力强，产酸迅速，终末pH3.95-4.1 。变链利用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）合成乳酸，主要酸性产物，导致菌斑内pH降低；LDH被认为是主要的毒力因子。 耐酸所谓耐酸是指变异链球菌能在酸性环境中生长和代谢，并在酸性环境中有继续产酸的能力。变链最低生长繁殖pH是4.8.耐酸基质：能将H+泵

11、出细胞，维持胞内合适的pH环境质子移位酶（proton-translocating membrane ATPase，H+-ATPase）完成这项工作，为跨膜蛋白，不受外界环境影响；消耗ATP，将H+泵出细胞，维持胞内外pH梯度；这一过程称为组成型耐酸性（constitutive acid tolerance）；不同微生物H+-ATPase最适活性pH不同（表） 诱导表达酸应激蛋白（acid-stress proteins）在酸诱导下，变异链球菌上调表达一些酸应激蛋白，这些蛋白是变异链球菌能够耐受酸作用；这种现象是耐酸反应性（acid tolerance response，ATR），指处于生长曲

12、线指数期的细菌在亚致死性pH生长一段时间后能产生酸适应性，从而抵抗致死性低pH的损伤作用（图解释）；应激蛋白：Ffh：参与蛋白易位；与H+-ATP酶等耐酸相关蛋白结合，协助完成蛋白生物功能，将H+-ATP酶易位至细胞膜；Dgk:参与细胞膜磷脂酸的合成，维持膜结构完整性；DnaK:催化新合成蛋白折叠，并使变形蛋白重新折叠；GluA: 催化磷酸葡萄糖转化为细胞膜糖磷脂前体，影响细胞膜；DltC：参与丙胺酰基脂磷壁酸合成，形成阻止H+流入细胞内屏障。胞浆内有酸性环境中保持活性的酶：维持糖酵解最低pH4.4，提供ATP，为H+-ATPase提供能量，泵出H+；合成水不溶性葡聚糖可阻碍H+扩散，起屏障作

13、用。合成胞内外多糖胞外多糖包括葡聚糖和果聚糖葡糖基转移酶（glucosyltransferase，GTF）合成葡聚糖的酶，变链固有酶；只能利用蔗糖做底物；最适pH5.5，pH5.2-7.0均有活性；具有蔗糖酶活性，裂解蔗糖为葡萄糖和果糖，随后将葡萄糖分子连接为葡聚糖；合成葡聚糖有水溶性葡聚糖（water-soluble glucan）和水不溶性葡聚糖（water-insoluble glucan），又称为变聚糖（mutan）；变异链球菌有三种GTF，分别有gtfB、gtfC和gtfD基因编码，不同GTF合成不同葡聚糖；gtfB对应GTF-I,位于细胞表面，是结合型蛋白，合成水不溶性葡聚糖；gt

14、fC对应GTF-SI，为结合型蛋白或游离型蛋白，存在与培养上清液中，合成水不溶性葡聚糖和少量低分子水溶性葡聚糖；gtfD编码GTF-S，为游离型GTF，合成水溶性葡聚糖；三组基因均存在于变链DNA中，gtfB、gtfC串联排列；gtfC编码GTF-SI对于变链形成的蔗糖依赖型粘附起重要作用；三种GTF氨基酸序列高度同源(图)，解释功能；远缘链球菌gtfI基因合成水不溶性葡聚糖，gtfS基因合成水溶性葡聚糖；血清型d的远缘链球菌合成水不溶性葡聚糖能力最强。胞外多糖图讲解变链产生胞外多糖致龋的特点（图）胞外多糖： 变链合成最多； 龋活性患者变链合成水不溶性葡聚糖多； 水不溶性葡聚糖与邻面龋相关，蔗

15、糖依赖性粘附； 水不溶性葡聚糖促进微生物共聚； 水不溶性葡聚糖形成生物膜结构，阻碍物质交换，维持生物膜内低pH； 致龋重要因素。果糖基转移酶（fricpsuamsferase，FTF）为变链固有酶；蔗糖为底物产生果聚糖；果聚糖为水溶性，与水溶性葡聚糖共同作为变链细胞外能源储备形式；外源糖不足时被降解产酸，致龋。 其他链球菌变链是主要致龋菌，但不是唯一的致龋菌。牙釉质早期脱矿可以在没有变链的情况下发生，非变异链球菌族（non-mutans streptococci）所致。牙菌斑内细菌产酸图，均可产酸，导致pH降低，造成釉质脱矿。血链球菌 牙菌斑先驱菌；形成水溶性葡聚糖；变异链球菌增多，血链球菌减

16、少；血链球菌检出率相同，但数量与龋呈负相关；推迟变异链球菌定植时间；变异链球菌数量/血链球菌数量预测龋风险 乳杆菌（Lactobacillus） 致龋有利证据： 产酸、耐酸； 龋洞中发现大量嗜酸、干酪、发酵乳杆菌； 诱发窝沟龋； 龋损程度与乳杆菌数量呈正相关； 口腔环境恶略，乳杆菌数量增加； 碳水化合物增加，乳杆菌数量增加。 致龋无利证据： 与牙面亲和力低； 不具感染性； 动物致龋实验失败。 放线菌（Actinomyces） 致龋证据： 发酵多种糖产酸； 能粘附牙面； 牙菌斑中比例高； 合成胞内多糖、水溶性胞外多糖； 流行病学证明与根面龋相关。 发酵多种糖产酸； 能粘附牙面； 牙菌斑中比例高；

17、 合成胞内多糖、水溶性胞外多糖； 流行病学证明与根面龋相关。 内氏放线菌基因II 菌毛I：与富脯蛋白和富酪蛋白结合； 菌毛II凝集素样成分，共聚； 产生涎酶-粘蛋白释放涎酸-暴露半乳糖-菌毛II粘附； 利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖产酸； 代谢产物乙酸、乳酸、甲酸、琥珀酸、乙醇等； 有氧代谢，生成乙酸； 无氧酵解，产生乳酸； 储存多糖，外源糖原不足时，多糖酵解产酸； 实验证实根面龋 第三节 致龋机制非特异菌斑学说 Miller提出：化学细菌学理论 产酸菌+碳水化合物酸 无机物溶解、有机物支架水解 龋 是菌斑内所有细菌作用结果，与菌斑组成无关 预防方法：去除菌斑 特异菌斑学说 不同部位牙菌斑、细菌组成不同 特异菌斑学说 分离出龋相关微生物 流行病学证明：变异链球菌多的牙面易患龋 非致龋菌 龋流行病学研究：釉质龋、根面龋、牙本质龋细菌组成不同 不同部位牙菌斑、细菌组成不同 分离出龋相关微生物 流行病学证明：变异链球菌多的牙面易患龋 菌斑中存在非致龋菌 针对特