血涂片的制备及染色

1、血涂片的制备及染色摘要血涂片是世界上使用最广泛的实验室检测方法之一，应用于疾病的筛查，发现，诊断以及监控。本文提供了在临床检验中制备及染色出优质血涂片的一种参考。虽然在如何人工制备血涂片上仍存在某些“工艺”，但是已尽可能采用了客观标准使得临床实验室能准备和染色出优质血片。本参考中包含固定和染色手工工艺中的问题解决方法。关键词：血涂片制备，染色前言血涂片是世界上使用最广泛和最频繁的检测方法之一，但似乎没有关于血涂片制备要求，程序及潜在问题等的综合性文献。虽然血涂片的制备是个简单的过程，但作为一种检测方法，有很多因素可导致检测失败或比其预期低效。本文应国际血液学标准化委员会的请求所写，并作为实验室

2、血细胞计数板的指导方针。本文旨在提供临床检验中用于形态评价的血涂片制备及其染色的指导和标准化。显微镜分析过程和解释不在本文的范围内。列举的方法中包括最先进的技术以及发展中国家实验室的适用方法。发展中国家不具备最高水平的指标，但应在所有条件下可达到其规定的指标，以确保诊断测试的质量，以免降低病人护理。这点尤其重要，因为无论对于病例发现，诊断或疾病监测，血涂片显微镜分析所得数据通常在临床情况中起最终和决定性的作用。为了方便参考使用，本文采用一种特殊的格式来描述涉及血涂片制备和染色的各个步骤。血涂片制备载玻片载玻片应由最高纯度的耐腐蚀玻璃制成；通常不可接受其他材料如塑料。典型玻片为7525mm，约有

3、1mm厚度，必须平整，无扭曲和波痕，而且必须澄清无色（“水白，无色透明”）。 荧光显微镜检测必须使用无自发荧光的玻片。最好使用预洗过的载玻片，但至少实验室必须确保载玻片无划痕，干净无尘、绒线，油脂（指纹），而且必须干燥。这就意味着在潮湿环境中，载玻片必须能抗水。在所处密闭容器开启后，载玻片必须保存于干燥器或装有无水（甲基）乙醇或乙醇与丙酮混合液（3:1）的容器内直至被使用。载玻片需一直保存于密闭容器中，只能在立即使用前开启。载玻片可以是平面的或有磨砂或涂层面以供书写。与有直角边缘的载玻片相比，圆边或有破口的载玻片使用上更安全，降低了皮肤和手套割破或刺破的几率。载玻片的清洗脏的载玻片需浸透在60

4、的清洁剂中清洗15-20分钟，然后用热水冲洗并干燥。新载玻片需置于重铬酸钾洗涤液中（20g Cr2K2O7溶于100mL水并加入900mL浓硫酸）48小时。之后用流动自来水彻底冲洗。载玻片应保存于95%甲醇中，使用前小心擦拭干净并干燥。血涂片制备方法典型的血涂片制备方法是：人工（楔入，盖玻片），半自动（楔入，旋转），以及自动（楔入）。楔入法（“推”）人工、半自动及自动化环境中常用此法。若正确使用楔入法，可有足够大的区域供显微镜检测使用：这种区域中所有的细胞彼此几乎不接触或分离（单层部分）。对于显微镜检查来说，涂片上距推动起始处最远的部分会很薄（导致产生形态改变），然而距推动起始处邻近的部分会很

5、厚。自动化装置能够制得优质的血涂片，比通过人工方法得到的血涂片相比更具一致性。楔入法制备的主要问题是不同类型细胞的不均匀分布。特别是单核细胞（以及其他大的白细胞）被推向铺展膜（“羽状”边缘）底部以及两侧。与以单克隆抗体为基础的流式细胞术分类计数仪相比，上述情况将导致单核细胞数被低估5%-10%（正常个体经显微镜检测的比例计算常限上限为11%，非10%）。盖玻片法（“拉”）小型盖玻片不能被恰当地标记，应避免使用。此外与楔入法相比，本技术自身存在更高的生物危害风险。这种方法被认为是过时淘汰的，不应使用。旋式血涂片此法可谓是楔入法的替代方法。经离心力大面积摊开血细胞后，单层血细胞可供显微镜检测。虽然

6、需注意避免污迹细胞的形成，但制备正确的旋式血涂片中所有类型的细胞形态通常是极好的。建议使用经生理盐水稀释后的血液，但出色的准备工作一般都离不开这一步。没有证据表明旋式血涂片制备会导致细胞类型的不均匀分布。过去的旋转离心机在所有实验室仪器中最具危险性，因为可形成小滴和气溶胶以及机器内部的血液污染。最近研制出的旋转离心机已能克服上述问题并且可安全使用。对于旋转离心机来说，为了获得一致的单层，采用精确正好的血量是至关重要的。因此，建议使用微量移液管滴涂血液，而不是毛细管。血液样本的类型血液样本的两种类型为静脉血（抗凝）和毛细血管血，毛细血管血是由毛细血管采血法（非抗凝）得到。已有些关于样品采集使用及

7、操作设备的标准化文献发表，读者可以参考这些文本细节。抗凝可使用的抗凝剂是K2EDTA或K3EDTA，柠檬酸钠以及枸橼酸盐葡萄糖（ACD：储血稳定剂）。不建议使用肝素，因易发生血小板凝聚，进而干扰血小板形态解释和血小板计数的估测。肝素也会导致染色涂片上紫色/蓝色色调的变化。样品保存影响血样应在采集后尽可能快速地进行处理。随着保存时间的延长以及时间和温度的影响，样品会发生较大的形态改变。为了获得最佳实验结果，血涂片应在血样采集后两小时内就制备好。保存温度如下：短期（8小时），4 较好，但室温下保存也可；长期，4。通常在长期保存后需经至少10次完全（180）倒置混合血样。毛细管推荐使用塑料（聚苯乙烯

8、或类似物）管（不易破损）把血滴滴至于载玻片上。应避免使用玻璃管，因为有破损的可能，这会导致生物危害。毛细管应光滑平整，不含肝素。可以选择使用专门为制备血涂片设计的血液容器螺旋帽打孔装置。血量滴加的血量应使楔入法制得的血涂片拥有合适的厚度，长度在2.5-4 cm。使用旋转离心机时，应使用微量移液管以确保单层细胞的均一性。对于典型的旋式涂片，30L血量能制得足够大的单层细胞，但是不同的血量需用不同的离心机。血滴位置血滴的位置应距载玻片末端大约1cm（与标记端相反）。或者选择距标签（或载玻片磨砂部分）1cm处。确定离心机中的位置时应按照制造商的说明。涂布器理想情况下，为了降低分配作用，涂布器应比载玻

9、片略窄。实际上，经常使用另一载玻片充当涂布器。充当涂布器的载玻片应有圆滑边缘或坡口，这使得载玻片的展宽比实际的载玻片宽度窄。涂布器使用后应丢弃或者在重新使用前彻底清洗并干燥。涂布器的边缘应总是平滑，以确保血涂片整宽的厚度均匀一致。在涂布器边缘若有先前样本的血细胞将导致血细胞明显移行到相邻血涂片中，包括红细胞中的疟原虫以及白血病白细胞。涂布器提取血样当血滴置于载玻片时，涂布器应以相对血滴大约30-45 角缓慢向后移动。血滴应沿着涂布器边缘快速铺展。一旦血滴沿着整个边缘铺展，涂布器就应成45 角并以稳定的相对较快的速率向前移动，直到全部血液铺展成膜。制备贫血患者的血涂片时，涂布器应保持更加垂直，一

10、边制得较厚的涂片。铺展/旋转速度血液在载玻片上铺展愈快，涂片愈厚。为了获得一致和合格的结果，需要一定的训练和经验。众所周知的是，某些样本很难由楔入法制备血涂片，例如新生儿的血样。对于旋式载玻片，离心速度和次数可从制造商处获知。血涂片厚度血滴的大小，病人的血红蛋白水平，涂布器的角度（角度愈大，血涂片愈厚愈短）以及铺展速度会影响血涂片的厚度。血涂片的干燥一般无强制空气循环下就足以晾干。在潮湿环境中，建议在采取适当的预防措施下进行强迫通风干燥，以防止气溶胶的形成。当采用强制干燥时，建议在配有高效微粒空气（HEPA）过滤器的生物危害罩中进行。制造伪像常见的伪像通常是由欠佳的涂布技术，潮湿环境中的缓慢干

11、燥，固定不充分或迟缓以及固定液含水造成的。不干燥的载玻片造成血涂片铺展欠佳或不规则，通常伴有较差的形态。某些细胞类型会在涂片制备时被轻易破环。特定条件包括大量的非典型淋巴球，慢性淋巴细胞白血病（CLL），以及急性白血病。有时这些破裂的细胞（“污迹”细胞）可通过在血涂片制备前添加白蛋白来避免。缓慢干燥导致细胞收缩，然而当甲醇固定液中水含量超过3%时就会造成明显的形态伪影，例如细胞形态的脆性降低（尤其是红细胞和细胞核）以及假液泡的形成。 退行性病变，例如单核细胞、中性粒（白）细胞的细胞质液泡化，核分叶或者有核细胞分裂以及凋亡通与其说是制备造成的，而不如说是由样品长期保存或保存不当造成的。可能的干扰

12、影响血涂片制备和质量的病情有：贫血、红血球增多症,脐带血，血小板凝集，冷凝集素，严重的溶血性贫血中的抗红细胞抗体，严重的红细胞叠连以及新生儿的血样。用于疟疾检测的血涂片制备公认的是通过血涂片中（厚或薄）的疟原虫形态识别不是检测疟疾最灵敏的方法。分子生物学方法更具灵敏性，但也很昂贵。因此，在今后有一段时间，疟疾的形态识别法会在很多实验室中存在并成为发现和监测疟疾的主要方法。薄或厚血涂片都可用于疟原虫的形态检测。用厚涂片识别疟疾比薄涂片灵敏10倍左右，但厚涂片中疟原虫类型的实际识别很难进行。对于厚血涂片的制备，小血滴置于玻璃载玻片上，铺展至比起始表面大约四面积倍。充分干燥后，最好在50-60下操作

13、，时间控制在7-10分钟，载玻片可以染色。若干燥不充分，细胞会被洗掉。两种染色程序：常规血涂片在30秒内快速染色，姬姆萨染色用于厚滴制备，大约需30分钟。有一种厚滴制备的替代方法，即经皂素的血细胞溶菌作用后离心分离除去杂质。网织红细胞制备抗凝血必须首先在体外活体染料中温育，网织红细胞中的RNA（主要是核糖体）被染色，这将导致RNA聚集成形态上典型的深蓝色网状（网状组织）和粒斑。染色液和血液在试管中等分混合，室温下温育15分钟。10次完全倒置再混合后，在显微镜分析之前，至少制备出2张风干的血涂片。固定/染色为了获得最理想的结果，应在血涂片完全风干后迅速固定并染色。建议在染色前对血涂片进行固定，但

14、许多实验室有在血涂片完全风干后就立即染色的习惯。这一过程经常产生不合格的结果。然而如果载玻片不能立即染色，那么在甲醇中固定4小时就变得很重要了，但是这一过程最好在风干1小时后；否则的话，血浆会产生灰/蓝背景影响。染色剂和固定液必须尽可能无水（3%），以防形态伪像。若进行人工染色操作，建议将载玻片沉浸于装有试剂（科普林氏缸）的广口瓶中而不是用染色剂覆盖载玻片，因为蒸发后可能会形成沉淀。若在极热环境下进行染色，必须防止染色过程中的蒸发，例如在一密闭广口瓶或密闭有盖培养皿中进行染色。自动化染色装置拥有其自己特定的染色程序，此程序由制造商提供。使用者可以修改这些程序来满足细胞染色的要求。不同实验室间的

15、染色方案不同，不存在被普遍接受的常规染色方法或结果。染色和染色结果的指导方针能在血液学和实验室指南和教科书中找到。国际血液学标准化委员会（ICSH）已经发布了一种基于纯天青B和曙红Y染色剂的血涂片“参考”染色方法。判断染色血涂片质量的一种通则是实验室必须确保血涂片中所有细胞类型可通过染色过程被可靠识别。此规则同样适用于人工和自动化的方法。血涂片通常由罗氏染料（含有各种噻嗪类和曙红）染色。其他若干方法如下：瑞氏染色，瑞氏-姬姆萨染色，May-Grnwald-Giemsa染色和利什曼染色。下面将对一些普遍采用的风干血涂片染色方法进行举例。瑞氏染色试剂（1）无水甲醇（2）染色剂（可从商业渠道购买现成

16、品或粉末）。通常将0.3g瑞氏染料粉末溶于100mL无水甲醇中，室温下保存于密闭容器中24小时。使用前必须过滤。（3）索氏缓冲溶液，pH 6.4；无水KH2PO4 6.63g，无水Na2HPO4 2.56g，蒸馏水稀释至1000mL。方法步骤 1.无水甲醇中固定至少30秒步骤 2.倾斜载玻片除去甲醇步骤3.载玻片水平放置，涂染色剂，保持2分钟步骤4.加等份不含任何染色剂的缓冲溶液于载玻片上。将缓冲溶液和染色剂轻轻混合，同时应避免接触载玻片上血涂片的表面（染色剂混合物表面将呈现金属光泽）步骤 5.静置3分钟步骤 6.用（蒸馏）水冲洗载玻片30秒步骤7.倾斜放置载玻片并干燥，不要吸干步骤 8.若需

17、要可添加盖玻片May-Grnwald-Giemsa染色试剂（1）无水甲醇（2）染色剂I：0.3g May-Grnwald-Giemsa染色粉末溶于100ml无水甲醇室温下保存于密闭容器中24小时。使用前必须过滤。染色剂II（姬姆萨染色剂）1g姬姆萨染料粉末溶于66mL甘油并在56下加热90-120分钟。添加66mL无水甲醇后充分混合，溶液应在室温下保存于密闭容器中。使用前必须过滤。（3）缓冲溶液：索氏缓冲溶液。May-Grnwald-Giemsa染色染色剂的pH必须为6.8，而瑞氏染色剂的pH为6.4。方法步骤 1.无水甲醇中固定至少30秒步骤2.倾斜载玻片除去甲醇或者简单地从固定广口瓶中移出

18、步骤 3.用等份缓冲溶液稀释染色剂I，涂于水平放置的载玻片上或在一广口瓶中，保持5分钟。步骤4.从广口瓶中移出载玻片，不要清洗（或者经垂直放置载玻片除去染色剂）至染色剂II中10-15分钟，此染色剂II应用9份缓冲溶液刚稀释过。步骤5.载玻片除去染色剂后移至装有缓冲溶液的广口瓶中步骤 6.用大量水冲洗载玻片步骤 7.将载玻片移至含水广口瓶中2-5分钟步骤8.倾斜放置载玻片并干燥，不要吸干步骤 9.若需要可添加盖玻片评论此方法中重要的一点是载玻片不允许在两步骤之间干燥或蒸发，以防形成染色伪像和沉淀。疟疾染色法常规血涂片，快速方法试剂染色剂I：将1.3g曙红Y溶于500mL含12.6g Na2HP

19、O412H2O和6.25 g KH2PO4的蒸馏水中。室温下与密闭容器中静置24小时。染色剂I也可经0.8g亚甲蓝和0.5g亚甲基天蓝（天蓝I亚甲蓝的氧化衍生物）溶于500mL含12.6g Na2HPO412H2O和6.25 g KH2PO4的蒸馏水中制得。确保步骤间无蒸发。染色剂II：将1.3g亚甲蓝溶于500mL含12.6g Na2HPO412H2O蒸馏水中，煮沸至干粉状以备进行多色染色。粉末应在500mL蒸馏水中重悬浮并添加6.25g KH2PO4。两种染色剂都必须在使用前过滤并保存于密闭容器中以防氧化。方法步骤 1.无水甲醇中固定至少30秒步骤2.在血涂片上滴加稀释过的染色剂I 12滴

20、（一份染色剂用四份蒸馏水稀释）步骤3.立即滴加未稀释的染色剂II 12滴并与已滴加在载玻片上的已稀释的染色剂I混合步骤 4.静置1分钟步骤5.沥干载玻片，放置于索氏磷酸盐缓冲液中，pH 6.6，保持5秒（为了充分染色）步骤 6.用水冲洗步骤7.倾斜放置载玻片并干燥，不要吸干室外染色干燥的或者其他未固定的薄涂片和厚血滴制剂可浸于染色剂I中1-2秒，然后用pH 6.8的索氏缓冲液冲洗，直至无染色剂从血涂片中释放。接下来将涂片浸于染色剂II中1秒并立即用相同的缓冲液冲洗。剩余的水经震动，非吸干除去后将载玻片垂直放置干燥。厚滴法（姬姆萨）试剂姬姆萨染色剂可直接购买获得或由实验室制备（见“May-Grn

21、wald-Giemsa染色”下“方法”）方法步骤1.将干燥的载玻片完全沉浸于广口瓶或将载玻片保持水平，用稀释过的姬姆萨染色剂染色（用pH 6.8的索氏磷酸盐缓冲溶液以1:10的比例稀释），保持20-30分钟。步骤2.用相同的缓冲溶液洗涤载玻片（轻轻地，否则血涂片将从载玻 片上漂浮）步骤 3.将载玻片倾斜或垂直放置干燥；不要擦干评论因这一技术的目的之一是溶解红细胞，使疟原虫透过几层细胞后可见，厚滴制备得到的大多数血细胞的形态欠佳。在稀释过的染色剂中浸泡过长时间会使制剂易于从载玻片上漂浮走。网织红细胞染色新亚甲蓝（1g）溶于100mL稀释液中（柠檬酸盐：20mL 30g/L柠檬酸钠加80mL 9g

22、/L氯化钠）。染料溶解后，在使用前必须过滤染色剂。关于染色和染料的总评染料和固定剂必须在室温下保存于密封容器中；冻结温度下会破坏罗氏染液。血涂片染色试剂应有标签来记录容器开启的时间；截止日期应标注于瓶身。虽然原材料易得以及所有的染色剂可由实验室配制，但是值得注意的是这是一个费力的过程。总之，使用现成的染色剂可以获得更一致的染色结果。染色血涂片的评价宏观上看，正确制备和染色血涂片应在其薄的部分呈粉色，厚的部分呈紫/蓝色。通过显微镜观察，红细胞应呈粉色，白细胞核应呈蓝偏紫色。涂片应不含或含极少沉淀，整个载玻片应染色均匀。血细胞应无液泡（见“固定/染色”）。染色伪像及潜在的染色问题过度粉色染色可能是

23、由于使用了较低pH的缓冲溶液，染色不充分或者过度洗涤/冲洗造成的。染色剂若超过四周，尤其是被暴露于空气时也会导致粉色，因为甲醇中会有甲酸的形成。应对措施：检查缓冲溶液pH，使用新制染色剂，其中的甲醇应未暴露于空气过，并且确保染色试剂正确，有时可能需要改变试剂批次。如果使用商品染色剂，缓冲溶液pH和染色时间需正确，尝试其他批次可能是必要的。在寒冷环境中，确保染色剂在运输中不会凝固。过度蓝色可能是由于使用碱性pH的缓冲溶液，染色时间过长，或者洗涤不充分造成的。厚血涂片也会导致细胞出现更蓝的现象。应对措施：检查缓冲溶液pH，使用更多稀释剂，以及/或者缩短染色时间。不充分染色的核通常是由于染色不充分造

24、成的，然而老化样本（采集血样超过8小时）中的有核细胞，尤其是在室温下保存时，可能表现出与凋亡（核破裂）一致的核变化。沉淀的形成可能是由于甲醇从染色剂中蒸发或因为不正确的洗涤过程，特别是在洗涤的初级阶段没有保持载玻片完全平整造成的。自制染色剂在使用前未充分过滤，使用不洁净的载玻片以及在血涂片或载玻片上落有灰尘也同样会造成沉淀。盖玻片一般而言，没有必要使用盖玻片，然而如果血涂片需经数人审评或长时间保存，盖玻片就可以提供保护以防力学损伤（反复擦拭）和染色剂由于暴露于空气发生变质。加盖玻片的潜在优点是用盖玻片覆盖患者血液的整个区域（染色和未染色）可以降低处理血涂片时的生物危险。盖玻片应由高纯无色玻璃（

25、“水白，无色透明”）制成，必须抗水化，尤其是当处于高湿度的环境中时。盖玻片应有均匀的表面质量，无任何不规则，完全平整。典型的盖玻片为2525 mm，厚度为0.13-0.17mm（其他范围的尺寸可从经销商和制造商处获得）。特厚盖玻片（0.17-0.25 mm）降低了破碎的几率，但是显微镜使用会受限。盖玻片对洁净度，水化以及保存的要求与玻璃载玻片相同。为了防止灰尘聚集和水化，盖玻片在不使用时应保存于密闭容器中。自动盖玻片仪可供大型实验室使用。封片材料为了永久装配盖玻片，溶于无机溶剂的合成树脂（甲苯和二甲苯）已经大部分替代了加拿大香脂（加拿大松脂或冷杉香脂），因其黄化和不易完全干燥不太令人满意。封片

26、材料应具有低粘性以确保粘合剂层较薄并防止气泡的形成。它不能因衍射问题或生物染色剂的颜色改变影响光学分析。封片介质中的抗氧化剂能防止染色剂和介质材料自身变色。封片材料不应随着时间的推移而失去粘性。不建议在不使用盖玻片的情况下就用封片材料充当血涂片的覆盖物，因为这些制剂易聚集灰尘，当经长时间保存和多次观察后，不像玻璃有防刮和防指纹的能力。标记血涂片应标记清楚，标签应不易模糊以及不易受用无机溶剂进行固定，染色和清洗的影响。标签内容至少包括患者姓名，时间以及样本采集时间，样本编号。可靠的标签也建议包括患者特定识别号。制备血涂片时建议使用印刷标签来标记（若使用压印型染色剂，在涂片背面标记可以避免标签污染

27、）。应检查印刷标签随时间褪色的可能性以及浸入油和实验室中常用溶剂时的敏感性。手工标记血涂片可使用铅笔、蜡笔（对乙醇或其他溶剂不敏感）、记号笔或钻石划针。生物危害处理所有患者的样本包括血涂片时应采取一般的预防措施，无论是风干、固定或染色。样本处理和血涂片制备血涂片的制备不是特别危险，但在打开血容器时必须小心，特别是用橡胶塞而不是螺旋盖封闭时。打开橡胶塞经常会导致小滴或微滴的形成，因此必须用擦布或类似物覆盖橡胶塞，最好在生物危害罩中进行并且远离操作者脸部。如果处理得当，使用带螺旋盖的试管时就不会形成可测量的微滴和气溶胶。血样也可从样本试管中通过使用血容器塞子穿孔装置安全地获得，这种装置专门为血涂片

28、制备设计。已染色血涂片像罗氏染液这样的嵌入式染料是致癌的，应小心处理，避免皮肤或粘膜接触。经常假定用罗氏染液染色的血细胞不具备传染性，一般来说经完全染色的血涂片不认为有生物危害性。然而甲醇固定液不能抗艾滋病或乙型肝炎，也不太可能为某些其他类型的传染病提供保护，例如朊病毒造成的传染病。部分染色的血涂片通常情况下，载玻片上的血涂片只有一部分被染色，因此未染色部分具有直接的生物危害性。盖玻片封装介质封装盖玻片时所使用到的某些材料和溶剂存在潜在致癌性，应根据制造商说明小心处理。试剂安全性本文提到的罗氏染液，甲醇，乙醇，丙酮，二甲苯，甲苯和盖玻片胶水具有高度的易燃性，应保存于为易燃材料所设计的安全橱中。

29、当处理这些试剂时，应考虑它们的挥发性和潜在的致癌性。长时间保存如果血涂片要长时间保存，应避免光照。尽管长时间保存时建议使用盖玻片，但如果未用盖玻片的已染色载玻片密封保存于密闭容器或安全橱暗处，干燥环境中时，涂片也不太可能发生变质。染色剂和溶剂的处理罗氏染液和挥发性溶剂应按照当地废物处理部门的相关规章制度进行处理。载玻片处理使用过的载玻片应放置于有特别标记的指定容器中，这种容器用于收集有生物危害性和锐利的物品。显微镜检查和载玻片处理基于“生物危害”中已提到的相关原因，当处理血涂片和进行显微镜分析时建议使用手套。与带有圆滑边缘或破口的载玻片相比，带有直角边缘的载玻片更易割或刺破皮肤或手套材质。破粹

30、的载玻片应极其小心处理，这样的载玻片应被丢弃，除非血涂片无可取代。血涂片的使用血涂片可以以多种方式使用。大部分用于常规临床定量和/或者定性分析形成的血液元素。用于形态筛选可能比纯定量目的更强，因为白细胞差异电子分析技术已有很大提高。血涂片也用于质量控制/质量保证以及评估以自动化设备为基础的方法。人工分类计数作为参照方法的作用以血涂片为基础的白细胞分类计数参考方法的作用，请参考美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）文件H20-A。注意事项需注意的一点是楔入法制得的血涂片中细胞分布情况；像单核细胞这样的大细胞可能会被推向血涂片的边缘以及羽化区。一般的形态学问题某些类型的血细胞（单核细胞，有核红细胞，杆状细胞等）不