微生物学课件：6 病原性球菌的分类鉴定（革兰氏阳性球菌的分类鉴定）

1、病原性球菌的分类鉴定（革兰氏阳性球菌的分类鉴定）在自然界中存在着各种各样、形形色色的细菌，这些细菌大小不一、形态各异、数量庞大、种类繁多，但根据其基本形态，我们可以把细菌分成三大类，即球菌的种类很多，根据革兰氏染色的不同，可将其分为革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性球菌两大类。革兰氏阳性球菌主要有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、微球菌等；革兰氏阴性球菌主要有脑膜炎球菌、淋球菌、卡塔尔布兰汉氏菌、黄色球菌、干燥球菌、皱缩球菌等。上述各种球菌中，有的是寄生于自然界或人体的正常菌群，正常情况下不引起疾病；有的对人有致病性。这些对人有致病性的球菌统称为病原性球菌。因其能引起机体的化脓性感染，所以又称为化脓性球菌

2、。这些病原性球菌均属于微球菌科、链球菌科和奈瑟氏球菌科。从结构上讲，它们均无芽孢，多数无鞭毛，少数可形成荚膜；从染色性上讲，前两个科属革兰氏阳性球菌，后者属革兰氏阴性球菌。 革兰氏阳性球菌包括需氧革兰氏阳性球菌和厌氧革兰氏阳性球菌两大类。需氧革兰氏阳性球菌又包括微球菌科和链球菌科两大科。一、 微球菌科的分类鉴定微球菌科细菌包括四个属，即微球菌属、葡萄球菌属、动性球菌属和口腔球菌属。其中微球菌属和葡萄球菌属可引起人类各系统的化脓性感染，而动性球菌属和口腔球菌属一般不引起人类疾病。（一）、微球菌属的分类鉴定微球菌属包括玫瑰色微球菌、活动微球菌、藤黄微球菌、易变微球菌、克氏微球菌、西宫微球菌、莱拉微

3、球菌、不动微球菌、盐生微球菌9个种，可从人体分离出来、具有一定临床价值的共三个种，即：玫瑰色微球菌、藤黄微球菌、易变微球菌。（二）、葡萄球菌属的分类鉴定 葡萄球菌是临床上所能见到的最常见的革兰氏阳性球菌。它能引起机体各部位的化脓性感染，特别是金黄色葡萄球菌，是病原性球菌中最重要的临床致病菌。根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版的分类，葡萄球菌属细菌共分为32个种，15个亚种，但在临床上能够见到、最具临床价值的种有：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌、猪葡萄球菌8个种。1、凝聚因子阳性菌群的鉴定2、凝聚因子阴性菌群的鉴定血浆凝固酶试验1、原

4、理：有些细菌如金黄色葡萄球菌在生长繁殖过程中可产生血浆凝固酶。该酶分为两种，一种由细菌产生后，不分泌到菌体外，而是结合在细菌细胞壁上，此类凝固酶又称结合凝固酶或固定凝固酶，也叫凝聚因子。凝聚因子是一种真正的凝固酶，它可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，后者附着在菌细胞表面，从而使细菌凝聚成团。玻片法凝固酶试验检测的即是凝聚因子。 凝聚因子 纤维蛋白原 纤维蛋白另一种凝固酶由细菌产生后分泌到菌体外。此类凝固酶称游离（分泌型）凝固酶。实际上，这类凝固酶并非是真正的凝固酶，而是一类凝固酶原样物质，它必须在血浆中的凝固酶致活因子（如Ca+）的激活下才能转变为凝固酶样物质，然后才能使血浆凝固。 凝固酶

5、致活因子（Ca+） 凝固酶原样物质 凝固酶样物质 纤维蛋白原纤维蛋白试管法凝固酶试验检测的即是游离凝固酶。2、方法：（1）、玻片法：在一洁净载玻片上滴加一滴生理盐水，用接种环挑取受试菌的12个菌落，乳化在生理盐水中，经1020秒确认无自凝后，挑取兔活人血浆一环，混合在乳化菌液中，10秒钟内出现凝集者为阳性。（2）、试管法：、取小试管三支，分别标以阳性（P）、试验（T）和阴性（N）字样。、其余操作见下表： 3、质控菌：阳性菌株：金黄色葡萄球菌；阴性菌株：表皮葡萄球菌。4、意义：用于葡萄球菌属的鉴定。5、注意：（1）、金葡菌不是唯一能产生血浆凝固酶的细菌。（2）、能产生血浆凝固酶的细菌并非都能同时

6、产生两种凝固酶。耐热核酸酶试验将待测菌的过夜肉汤培养物置沸水浴15min后，滴加于含甲苯胺蓝核酸琼脂上已打好的直径为25mm小孔内，置35孵育，1h后观察结果，绕孔周围蓝色琼脂转变为粉红环为阳性。碱性磷酸酶试验 1、原理：磷酸酶是一种磷酸单脂酶，他作用于磷酸单脂，使磷酸单脂水解，氧和磷之间的健断裂（COP），无机磷酸盐从磷酸单脂中释放出来。由于该酶在碱性条件下具有最适催化活性，故称碱性磷酸酶。当把能产生碱性磷酸酶的细菌的菌悬液与无色的对硝基苯磷酸盐溶液混合，后者受碱性磷酸酶的作用裂解生成无机磷酸盐和黄色的对硝基苯酚。从而使溶液变黄。2、试剂：（1）、0.1% 对硝基苯磷酸盐水溶液。（2）、0.

7、025M Tris 缓冲液（pH8.0）。 3、方法与结果（方法一）：（1）、用无菌棉拭子取试验菌的菌落，用Tris 缓冲液（pH8.0）稀释，比浊，使其浊度相当于9108细菌/ml（相当于麦氏比浊管第三管）。（2）、取上述菌悬液0.5ml加入一无菌试管中，然后加入0.5ml 0.1% 对硝基苯磷酸盐水溶液，置37水浴种1小时，观察结果。若菌液颜色由无色变为黄色，即为阳性反应。（方法二）将待测菌种点种在加有硝基酚磷酸盐的pH5.66.8MH琼脂上，孵育1824h，菌落周围出现黄色为阳性。吡咯烷酮芳基酰胺酶（PYR）试验1、原理：细菌产生吡咯烷酮芳基酰胺酶，水解L-吡咯烷酮-萘酚酰胺（PYR）基

8、质，释放出-萘酚酰胺。后者与试剂N,N-二甲氨基肉桂醛反应，产生桃红色颜色反应为阳性。2、培养基：称取相当于1000ml容量Todd Hewitt培养基干粉（用于B群链球菌-溶血素制备中金黄色葡萄球菌的培养），加琼脂15g，高压灭菌备用。称取PYR400mg，溶于4ml甲醇，无菌过滤后，加入前项培养基中，倾注成平板。 3、PYR产色试剂：1g N,N-二甲氨基肉桂醛溶于含25mmol/L TritonX-10的50ml 10%的浓盐酸中。4、方法及结果：将被检菌株接种上述试验平板上，3537过夜培养后，加入一滴PYR试剂于菌落上，1min后，菌落出现桃红色为阳性；若菌落为黄褐色为阴性。 5、质

9、控菌：阳性菌株：金黄色葡萄球菌；阴性菌株：表皮葡萄球菌。6、意义：用于葡萄球菌属的种间鉴别。二、 链球菌科的分类鉴定链球菌科目前共分为7个属，即：链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、气球菌属、孪生球菌属、平面球菌属、无色藻菌属。其中链球菌属是该科中最常见最主要的临床致病菌。（一）、链球菌属的分类鉴定链球菌属细菌种类多、分布广，主要寄生在人和某些动物的体内和体表。其中某些菌种是毒力强的致病菌；另一些则是作为正常菌群栖居于宿主的呼吸道、消化道等；还有一些是皮肤上的过路菌和粘膜上的定居菌。1、 链球菌的分类：链球菌的分类方法很多，常用的有以下几种：（1）、根据溶血能力分类：根据链球菌在血琼脂平板上的溶血能

10、力，可将链球菌分成三大类。、甲型（）溶血性链球菌：此型在血琼脂平板上生长后，菌落周围有草绿色溶血环，故又称草绿色链球菌。甲型链球菌是人类呼吸道及肠道中的正常寄生菌，其致病力较弱，但在一定条件下可引起心内膜炎、泌尿道感染及脑膜炎。、乙型（）溶血性链球菌：此型链球菌能产生溶血素。在血琼脂平板上可形成针尖样小菌落，菌落周围有24mm宽的透明溶血环。该群链球菌致病力较强，常引起人或动物多种疾病。、丙型（）链球菌：此型链球菌不产生溶血素，在血琼脂平板上可形成中等大小的菌落，菌落周围无溶血环，故又称不溶血性链球菌。该型链球菌无致病力，存在于乳类及粪便中。（2）、根据抗原结构分类：链球菌的抗原结构比较复杂。

11、目前对乙型链球菌抗原研究较多，其抗原可分为特异性抗原和非特异性抗原两大类；特异性抗原又可分为群特异性抗原和型特异性抗原。 抗原结构是链球菌属分类的重要依据。 如Lancefield等根据群特异性抗原的不同，将乙型溶血型链球菌分为A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T等18个血清群；对人类有致病性者，90%属于A群，偶可见到B、C、D、G群链球菌感染。此外，在一个血清群的链球菌之间，还可因型特异性抗原的不同分为若干个血清型，如A群可分为60多个血清型；B群可分为4个血清型；C群可分为13个血清型。（3）、根据需氧性分类： 分为需氧链球菌、微需氧链球菌、厌氧链球菌。 （4）、综合性分类； 根据溶血性、抵抗力、生化反应等性状将链球菌分为：草绿色链球菌、溶血型链球菌、口腔链球菌、乳链球菌和厌氧链球菌。 2、链球菌的鉴定程序胆汁七叶苷试验（二）、肠球菌属的分类鉴定 肠球菌属广泛分布于自然界，常栖