药物体内过程评价课件

1、药物体内过程评价通过定量研究药物进入人体后的吸收、分布、代谢和排泄（ADME)等过程进行的。目的：揭示药物剂型因素、生物学因素和药物效应间的关系。取决于肠内酶及细胞对药物的代谢及屏障作用第一节 药物体内过程评价的一般方法一、药物吸收试验（一）药物口服吸收评价方法药物吸收？获得药物在肠道的吸收动力学、有效吸收部位、吸收机制、影响吸收的因素研究肠吸收方法指导处方设计第一节 药物体内过程评价的一般方法（一）药物口服吸收评价方法在体肠回流法肠襻法外翻囊法分离肠黏膜法Caco-2细胞模型法主要研究方法1.在体肠灌注法(in situ intestine perfusion)大鼠麻醉开腹，肠腔插管用等渗生

2、理盐水洗净肠腔内容物用恒速泵使灌注液在肠腔内循环灌流，药物透过上皮细胞，吸收 不同时间测定灌注液内药物的浓度变化第一节 药物体内过程评价的一般方法注意事项用等渗生理盐水浸渍的纱布覆盖于肠组织表面以保湿保温加入不吸收的酚红或放射性标记聚乙二醇4000进行浓度校正1.在体肠灌注法优 点：保持了生理状态，与整体实验动物的吸收研究最接近； 考察吸收过程药物的代谢情况；能排除肝首过效应以及药物在肠壁组织中的代谢等生物转化对吸收的影响测得的参数能较真实反映药物的透膜特性1.在体肠灌注法缺 点：该法只限于溶液状态给药，结果准确性受多种因素的影响。改进措施1.同时取血液测定吸收的药物量；2.在灌注方式上选择单

3、向灌注，振动灌注和循环灌注1.在体肠灌注法文献1文献2文献31. 研究药物在小肠内的吸收机制是否为被动扩散、其吸收过程有无载体参与。在体肠灌注模型的应用在体肠灌注模型的应用 实验中通过比较药物不同剂量组的Ka、t1/2、单位时间的吸收百分率确定其在小肠内的吸收机理。如不同剂量组的以上三种参数没有显著差异则表明，其吸收过程为单纯的被动扩散。如随着剂量的增加，其Ka减小，吸收半衰期延长、表观渗透吸收减小，则说明该药物在小肠内的吸收具有载体介导转运特征。原位肠灌注实验中肠段的选取方法为： 小肠（全肠段）自幽门1cm开始到盲肠上端 十二指肠段 自幽门1cm开始至下行10cm 空肠段 离幽门15cm开始

4、下行10cm 回肠 离盲肠上行20cm至下行10cm 结肠段 盲肠后端至下行10cm处2. 通过小肠原位灌注实验确定药物小肠吸收的最佳部位，为药物剂型设计提供参考。通过对不同肠段药物的吸收速率常数（ka）、吸收半衰期（t1/2）和每小时吸收百分率的比较确定其最佳吸收肠段。对供试溶液循环时，比较结扎胆管与不结扎胆管两组的药物吸收数率常数进行检验比较。如结扎胆管组的Ka大于不结扎胆管组，提示该药物可能通过胆管分泌。 3. 揭示药物的肠分泌特征和胆汁对药物吸收的影响比如，通过实验发现黄芩苷在肠内经过菌群代谢为黄芩素而被吸收，被吸收的或静脉注射的黄芩素可在体内还原为黄芩苷，被小肠分泌排出4. 揭示药物

5、在小肠吸收过程中有无相互转化文献42.肠襻法大鼠麻醉开腹腔，肠腔结扎将含有药物的人工肠液注入肠襻中取出肠襻，收集冲洗肠腔内肠液，测定其中的药物剩余量，进而了解药物肠吸收情况。经过一定时间吸收 特点：操作简单，分析时样品处理较复杂。3.分离肠黏膜法大鼠麻醉开腹腔，肠腔插管洗净内容物，取出肠段套在玻璃棒上分离制得肠黏膜，固定于扩散池上，测定药物透过上皮细胞的情况。刮掉上皮下组织 3.分离肠黏膜法通过改变扩散池供药室溶液组成考察离子，pH值及制剂辅料等对透膜吸收的影响通过改变取样部位（黏膜侧或浆膜侧）考察药物不同方向转运情况，了解是被动转运还是主动转运还可以进行肠道代谢的考察3.分离肠黏膜法特点：

6、1. 肠黏膜易于破损，操作较困难；2. 不同肠段因组织结构的差异，表现出对药物透过屏障的作用不同，可影响吸收研究结果4. Caco-2细胞模型法来源于人的结肠（直肠）癌组织。Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态上十分相似，具有相同的细胞极性和紧密性连接。1.对聚乙二醇，甘露醇等不能穿过2.代谢酶类似：谷氨酰胺转肽酶，碱性磷酸酶，细胞色素P450同工酶等Caco-2细胞模型的跨膜转运实验，可以用来模拟药物在体内经小肠上皮吸收的过程4. Caco-2细胞模型法1、能够在细胞水平提供关于药物分子通过小肠黏膜的吸收，代谢，转运的信息,较之以往的翻转囊、肠襻实验及在体肠吸收模型更适合药物吸收进入肠黏膜

7、细胞的研究；2、可用于组合化学药物库的高通量筛选；3、无种属差异，重现性好。优点： 4. Caco-2细胞模型法1、缺乏粘蛋白产生细胞，2、此模型不能说明生理参数，如小肠流动性或运送时间在药物吸收中的作用；3、细胞培养时间和代系对Caco-2细胞的形态学和生理学性质有影响，从而影响细胞对药物的转运；4、不同实验室之间的培养条件的差别， 使结果缺乏可比性。缺点： 4. Caco-2细胞模型法1、加速的Caco-2细胞穿透模型2、TC-7模型改进： 例1例2（二）药物口服吸收特征的预测方法1、整体动物，直观， 但需消耗大量的样品和实验动物，且筛选数量有限，成本较高。2、组织、器官水平药动学筛选模型

8、仍效率低、自动化程度低、结果影响因素多3、细胞水平和基于药物-生物膜相互作用的体外药动学筛选模型， 速率快、成本低、方法重现性好等。1、Caco-2细胞模型：已经作为目前研究药物经小肠吸收和转运的经典体外模型，也是预测药物口服吸收特征的方法之一。常用细胞和体外模型2、平行人工膜穿透分析：为Caco-2细胞模型的替代方法。 使用的穿透膜由磷脂合成，与Caco-2细胞相比，适用的pH值范围广，对二甲基亚砜耐受性较高，穿透速率依赖于磷脂膜材料的性质，成本较低，方法容易改进。缺点：耗时，穿透数值的测定要求准确地测量释放池和接受池的药物浓度。常用细胞和体外模型2、色谱方法常用细胞和体外模型药物作用的动力

9、学过程被认为和色谱基本过程是相似。(1)固定人工膜柱色谱 将不同的磷脂，以单分子层化学键键合在固定相上形成人工膜，进行色谱分析的方法。优点：试验简单，可用于药物开发研究初期的大量筛选。(2)固定脂质体色谱 脂质体混悬于水中，化合物在脂质体双分子层和水之间进行分配可得脂质体-水分配系数。优点：用于制备脂质体的材料磷脂、蛋白质、胆固醇的比率，可以调节到与生物膜的组成很相似的程度。2、色谱方法（3）胶束液相色谱技术（4）生物分配胶束色谱常用细胞和体外模型（三）其他给药途径的吸收研究方法1、药物透皮吸收研究方法2、药物口腔吸收研究方法自学二、药物体内分布试验 对试验药物在生物体内的分布规律、蓄积情况、

10、主要蓄积器官或组织、蓄积程度，以及分布与药物效应间的关系进行研究的过程。试验动物：小鼠或大鼠选定药物的一个有效剂量后，分别在吸收相、分布相和消除相各选一个时间点（每个点至少应有5只）取样测定药物的浓度。样本：包括心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、子宫或睾丸和肌肉等重要组织，特别是能确定药物的效应靶器官和毒性靶器官中药物的分布特征。三、血浆蛋白结合试验药物与血浆蛋白结合物直接或间接地影响了药物吸收、分布、代谢和排泄过程。只有游离的分子，才能透过毛细血管到达其作用的靶部位产生药物效应。药物与血浆蛋白结合，也影响了药物临床应用的有效性与安全性。在新药的血浆蛋白结合研究中，以血浆蛋白结合率测定为主要目的

11、。常用方法平衡透析法超滤法超速离心法各种色谱法应选用一种方法至少进行3个药物浓度（包括有效浓度在内）的血浆蛋白结合率试验，每个浓度至少应重复试验3次，以了解药物的血浆蛋白结合率是否有浓度依赖性1游离型药物与结合型药物（非特异性的结合）在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10与药物 结合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂 蛋白 弱酸性药物主要与白蛋白结合 弱碱性药物与白蛋白、a1-酸性糖蛋白结合药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）2血浆蛋白结合率Df+P Db K= 解离常数血浆蛋白结合率： = =PDfDbDbDb+D

12、f11+K/np+Df/np 结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。由此可见，K、np是影响的重要因素 np K 药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。 3血浆蛋白结合的测定平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。（1）平衡透析法 原理 计算= 100% 袋内-袋外袋内药物注意事项a. 蛋白质溶液 新鲜血浆 pH7.4，至少三个浓度测定b. 缓冲液 0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4 抑制酸性药物与蛋白质结合c. 温度与平衡时间 37 1648h

13、注意防腐剂加入，药物的分解d. 透析袋 渗漏检测 3%三氯醋酸e. 搅拌 保持动态平衡影响因素a. 药物膜上吸附b. Donnan效应 由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。c. 空白值增加d. 缓冲液体积变化，水分进入血浆 游离药浓 此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用（2）超滤法原理 计算注意事项 a装置 50l5ml，选择不同型号超滤膜，保湿。 b速度与时间 300010000r/min 515min c温度 37，25，4影响因素 a膜吸附 b超滤液的体积 超滤液/总体积0.30.6 c超滤膜温度三、药物与血浆蛋白结合对体内药物

14、分析的影响1血浆不同对体内药物分析的影响 2平衡状态不同对体内药物分析的影响 3平衡状态受破坏对体内药物分析的影响4游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响（二）超滤法取血浆或血清与药物混合，恒温振荡至平衡后，用离心力或加压使溶液中的游离药物通过半透膜，然后再分别测定超滤液和超滤前蛋白质溶液中药物浓度，最后计算出药物的血浆蛋白结合率。优点：实现血浆中游离药物的快速分离，仅十几分钟至数十分钟即可收集到足够供测定的血浆超滤液，加之与高灵敏度的液质联用技术相结合，超滤法已广泛用于大规模生物样品的游离药物浓度测定。缺点：1）分离过程中存在结合平衡不稳定2）对高蛋白结合率药物的游离浓度难以准确检测3）结

15、合药物在透过滤膜时会出现泄漏4）超滤装置对药物具有吸附性（三）超速离心法（四）色谱法1、凝胶过滤法2、亲和色谱法3、高效前沿分析法其他方法（自学）四、药物生物转化试验药物在体内发生化学结构改变，导致药物药理活性发生相应变化的过程，称为药物的生物转化（biotransformation)或称为机体对药物的代谢（metabolism）1、研究对象的个体差异2、药物代谢研究大多选用健康成年男性为受试者3、药物代谢的预测要考虑受试者的年龄、性别、疾病状态、遗传因素、诱导和抑制引起的酶学改变、食物的影响等诸多因素。肝脏药物代谢研究方法1、细胞色素P450（CYP450）是一组含有亚铁血红素蛋白的酶，被称

16、为混合功能氧化酶或单加氧酶。许多P450具有遗传多态性，是引起个体间及种族间对同一底物代谢能力不同的原因之一。细胞色素P450CYP450命名方法：根据P450分子的氨基酸序列，能反映种族间P450基因超家族内的进化关系的统一命名法。凡P450酶系的氨基酸同源性大于40%,则视为同一家族，以CYP后标示数字表示，如CYP2；氨基酸同源性大于55%为同一亚族，在家族的表达后加大写英文字母，如CYP2D；每一亚族中的单个P450酶，则是在表达式后再加上一阿拉伯数字，如CYP2D6。人体肝脏中已有CYP450中的20多种同工酶，分为4个家族（CYP1-CYP4），它们与药物代谢密切相关，其中CYP3

17、A亚家族担负着最广泛的药物及内源性物质的代谢，该亚家族异构酶最丰富，约占人肝脏CYP总量的30%，肠CYP总量的70%。细胞色素P450细胞色素P450CYP3A4 是人体肝脏主要的药酶，约有38个类别，共计150多种药物是他的底物。CYP1A2是另一个重要的药酶，在药物代谢、前致癌物活化过程中有重要作用，其含量与活性不仅与药物效应有关，还与部分肿瘤易感性密切相关。 可直观地反映作为生命机体的整体在生理状态下的药物代谢情况，但结果易受个体的健康状态、合并用药影响，试验的实施受伦理道德的限制。2、药物代谢的整体试验方法3、药物代谢的离体试验方法可以排除体内因素对测定结果的干扰，直接观察底物的选择

18、性代谢，为药物代谢的整体试验提供可靠的理论依据。（1）离体肝脏灌注法（2）器官组织切片法（3）肝微粒体体外温孵法由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系。3、药物代谢的离体试验方法一般用差速离心法，贮存将其存放在-70C -40C的低温冰柜中，并在使用时检测药酶活性。肝微粒体的制备肝微粒体体外温孵法，较其他的体外代谢方法的酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究。3、药物代谢的离体试验方法（4）肝细胞体外培养法（5）转基因细胞系法（6）“人源化”整体动物模型法（五）药物排泄实验1、尿排泄实验 取实验动

19、物，置于代谢笼内，预先收集空白尿样后，收集给药后不同时间段的尿液。然后，测定尿液中药物或其代谢物浓度，评价药物经尿排泄的速率与程度。当药物或其代谢物以葡萄醛酸结合物、硫酸酯等形式排泄入尿时，可以用酶进行结合物的水解，而后进行测定。尿排泄实验常用方法 代谢笼法、导尿法、压迫膀胱法、输尿管插管法、膀胱插管法。2、胆汁排泄实验对胆总管进行插管可获得胆汁。以大鼠为实验动物进行胆汁排泄实验。分时段收集一定体积的胆汁，测定胆汁中药物或其代谢物浓度，评价药物经胆汁排泄的速率与程度。对结合型药物或其代谢物，仍可用酶水解方法水解后，再测定药物的浓度。3、粪排泄实验用代谢笼，可以分离、收集粪样，经处理后，可以测定

20、粪便中药物或其代谢物浓度，评价药物经粪排泄的速率与程度。第二节 新药开发研究中的药物体内过程评价药品注册管理办法于2007年6月18日经国家食品药品监督管理局局务会审议通过，现予公布，自2007年10月1日起施行。 中药、天然药物注册分类及申报资料要求 化学药品注册分类及申报资料要求 一、药物体内过程评价在新药开发研究中的作用临床前药物体内过程评价的目的：揭示新药在动物体内的动态变化规律，阐明药物吸收、分布、代谢和排泄等过程的动力学特征，并根据数据模型提供重要的药动学参数，为药理学、毒理学、药效学、临床试验，以及临床合理用药提供参考资料。通过对先导化合物体内过程评价，初步判断是否具有进一步开发

21、研究的必要；通过对药动学规律的揭示，为药物剂型选择、剂型设计提供依据，并提供制剂体内质量评价的指标与方法；通过测定体液、组织和器官中的药物浓度，分析药物效应、药物毒性与体内浓度间的相关关系，进行药物体内分布与药物效应靶器官相关性分析；临床前药物体内过程评价的作用：通过对药物在不同种属动物体内过程评价，了解药物体内过程的种属差异，为药物药效种属差异的分析提供依据；通过对动物体内过程规律的认识，为新药临床药动学、药效学、毒理学研究及临床应用提供依据。临床前药物体内过程评价的作用：一、药物体内过程评价在新药开发研究中的作用临床药物体内过程评价的目的：旨在了解新药在人体内吸收、分布和消除的动力学规律与

22、特点，揭示疾病对药物体内过程的影响规律，探讨联合用药的药物体内过程相互作用等。二、新药临床前体内过程评价的基本内容与要求（一）试验药品质量稳定且与药效学或毒理学研究所用试验药品一致。一方面可用于指导药物的处方筛选和制备工艺优化；另一方面可用于揭示新药的药动学特征及其与药物效应间的相关关系。（二）临床前药动学评价常用实验动物有犬、小鼠、大鼠、家兔和豚鼠。药物动力学研究应从同一动物多次取样，尽量避免合并样本的研究方法。创新药物应选用两种动物，其中一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物；其他类别药物，可选用一种动物进行实验；口服药不宜选用家兔等食草类动物。同一动物多次采样的试验，每个时间点至少应有3

23、只动物的给药数据。当不得不采用合并样本的研究方法时，每个时间点至少应有5只动物的给药数据。在进行速释、缓释、控释制剂药动学研究时，原则上应用成年beagle犬或杂种犬，其体重差值一般不超过1.5kg。至少应设3个剂量组，其中1个剂量应相当于药效学试验的有效剂量，高剂量一般接近于该药物的最大耐受量，以了解药物在体内的动力学过程是否有非线性动力学特征。剂量取样点应兼顾吸收相、分布相和消除相。取样点通常可安排9-13个，即吸收相应取样2-3次，达峰浓度处取样2-3次，分布相取样2-3次，消除相取样3-4。取样一般持续到3-5个半衰期或血药浓度Cmax的1/10-1/20。数据处理采用适宜的房室模型或

24、非房室模型方法进行数据处理，计算药动学参数。（三）组织分布试验必须注意取样的代表性，如仅取1/4或1/2个肾脏时，应注意取样的对称性。试验中，若发现药物在某组织的药物浓度较高，则应进一步研究药物在该组织的消除情况。（四）血浆蛋白结合试验选用一种方法至少应进行三个浓度（应包括有效浓度在内）的血浆蛋白结合率试验，每个浓度至少重复试验3次，以了解血浆蛋白结合率是否有浓度依赖性。（五）排泄试验至少应有5只动物的试验数据。选定一个有效剂量，给药后按一定的时间间隔分段收集全部的尿液、粪便，直至收集到药物已排尽为止。对尿、粪便应每隔一定时间收集1次，以测定药物经此途径排泄的速率。（六）结构转化试验在创新药物

25、的生物转化试验中，微量代谢物的分离、纯化及结构确证是十分困难的。三、新药临床药动学研究的基本内容与要求（一）新药临床药动学研究的基本内容在新药期临床试验中，应进行健康受试者的药动学研究，包括单次给药的药动学研究和多次给药的药动学研究。在新药期或期临床试验时，临床药动学研究内容包括新药在相应患者体内的药动学研究，以及单次给药和多次给药的药动学研究，以了解病理状态对新药体内过程的影响。（二）新药临床药动学研究的基本要求1、临床药动学研究的GCP要求保证药物临床试验过程规范，结果科学可靠，保护受试者的权益，并保障其安全。课题研究方案必须经负责该课题研究单位的伦理委员会批准。2、受试药物的要求应在符合

26、GMP条件的车间制备，制备过程应当严格执行GMP的要求。申请人对临床研究用药物的质量负有全部责任。3、受试者的选择在新药期临床试验中，当药物毒性过大，有可能对受试者身心造成损伤时，选择健康受试者是不适宜的，应选用患有相应疾病的患者作为受试者，并在期或期临床试验时完成，如细胞毒性类抗肿瘤药物、抗心律失常药物、具有较大依耐性的镇痛药等。4、药物剂量确定根据期临床耐受性试验结果和期临床试验拟采用的治疗剂量，可确定临床药动学试验的给药剂量，通常要求2-3个剂量组。5、药时曲线的数据测定试验期间受试者均应在监护室内接受观察，并避免剧烈活动，禁止饮茶、咖啡和含咖啡饮料。单剂量试验时，12例以上受试者，在试

27、验前1d的晚上统一进清淡饮食，进入监护室或病房，而后禁食，不禁水，过夜。次日晨，受试者接受空腹给药试验，药物用150-200ml温开水送服，2h后统一进早餐，4h以后统一进午餐。6、药时曲线数据处理一般选用房室模型或非房室模型法进行处理，并估算新药的主要药动学参数。单次给药需获得的主要药动学参数包括Ka，Tmax ,Cmax , AUC, V, K, t1/2和Cl等。7、新药临床药动学研究报告提供充分的生物样本检测方法的建立与评价结果；提供各个受试者的血药浓度-时间数据及曲线图、血药浓度-时间数据的平均值及曲线；提供各受试者的主要药动学参数及平均值；对多次给药与单次给药的药动学规律与特点进行比较，并对新药临床药动学规律和特点进行扼要的讨论和小节。第三节 药物体内过程评价中的生物样品检测方法一、生物样品