细胞工程第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术精选课件

1、 主要内容： 第一节 细胞工程实验室组成 第二节 无菌操作技术 第三节 培养基组成及其配制 学习的目标与要求： 了解细胞工程实验室的组成及所需的各种实验仪器，掌握细胞工程中各种实验仪器的操作及无菌操作技术，了解细胞工程所用培养基的组成成分及配制。基本实验室辅助实验室实验室组成准备室（通用实验室）缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室第一节 细胞工程实验室组成一、实验室组成1、组成 化学实验室、洗涤室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室和温室或大棚等。（1）化学实验室（准备室）： 完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。 主要设备： 药品柜、防尘橱

2、（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器。 （2）洗涤、灭菌室： 完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。 主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。（3）无菌操作室（接种室）： 主要用于动植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。 主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。（4）培养室： 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则

3、。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设4-5层，最低一层离地高约l0cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计， 如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h

4、，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。 主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。二、基本设备及使用1、接种设备：无菌超净工作台 用于培养材料的消毒及接种。使用前，将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭菌15min后，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。 超净工作台超净工作台使用注意事项 1、使用超净工作台前，应提前开机并开启紫外灭菌灯30分钟以上。2、使用超净工作台时，关闭紫外灭菌灯，

5、开启日光灯，并用70%75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面 。3、操作区不允许放置不必要的物品，保持洁净、气流通畅。整个实验过程中，实验人员应按照无菌操作规程操作。 4、使用完毕，应擦净工作台面。 2、高压蒸气灭菌锅 用于培养基、蒸馏水和接种器械的灭菌消毒。(1)高压蒸气灭菌锅工作原理： 在密闭的蒸锅内，0.1MPa的压力下， 锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。(2)使用方法：首先检查灭菌锅内是否有水，而且水刚好淹住加热器，然后放入灭菌材料，对称拧紧灭菌锅上的螺丝，关闭放气阀通电。待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表

6、指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.1-0.15Mpa时，维持20min后，断电，待压力降至零时，打开入气阀，取出灭菌材料。(3)注意事项：对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间；对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min；高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。因此，调PH值时，可适当调高0.10.3个单位。接通电源前一定要加入足量的水。电炉推车酒精

7、灯封口膜接种器具灭菌器培养瓶3、相关仪器 4、接种工具镊子解剖刀接种针酒精灯5、培养设备带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培养。恒温箱：又称培养箱，可用于原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养材料的保存及暗培养。摇床与转床：在液体培养基中，可改善培养基中的培养材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个细胞。但注意要设定适合的温度及转速。恒温振荡培养箱 光照培养箱 6、细胞培养设备 摇 床光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜7、细胞学鉴定设备分注器血球计数器移液器磁力搅拌器低速台式离心机8、其它辅助设备培养基灌装机及洗瓶机 除湿机：使培养室的湿度保持在定的范围内。空

8、调机：用于接种室和培养室温度的控制。烘箱：用于干燥洗净后的玻璃器皿，还可用80的温度烘干组织培养植物材料以测定干物质。冰箱：用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储藏，细胞组织和试验材料的冷冻保藏，以及某些材料的预处理。纯水机与蒸馏水发生器天平：天平包括分析天平，电子天平，药物天平等，用于制备母液时培养基组成成分的称取。如一些需要量少的激素和微生素类物质，天平的精确度要到0.0001g，这就要求精确度更高的分析天平。酸度计： 用于校正培养基和酶制剂的PH。温室（大棚）：第二节 无菌操作技术一、实验仪器及洗涤二、常用灭菌和消毒方法1、 玻璃器皿的选择与清洗培养皿三角瓶培养瓶试管一、实验仪器及洗涤

9、不锈钢锅磨口瓶烧杯滴瓶量筒滴定管容量瓶2、玻璃器皿洗涤（*注意污染的玻璃器皿 P14）新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿3、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用4、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干二、灭菌和消毒方法1、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。2、灭菌方法 物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、 过滤、离心、沉淀等 化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌3、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在

10、9.810410.8104Pa温度在 121灭菌1530min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌（3）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净工作台紫外灯照射70%75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射三、实验室常用的消毒与灭菌技术1、物理方法（1）湿热灭菌（培养基） 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有

11、几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到01MPa时压力0.1-0.15MPa，20min。 （2）灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ） 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 （3）干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） 干热灭菌是利用烘箱加热到160-180 的温度来杀死微生物。由于在干热

12、条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新 污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。 （4）过滤灭菌（不耐热的物质 ） 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为0.45m以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细

13、胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。 （5）紫外线和熏蒸灭菌（空间）紫外线灭菌 : 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m

14、为宜。熏蒸灭菌 ： 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按58mlm3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。 化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。

15、还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。（6）喷雾灭菌（物体表面） 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%1%的新洁尔灭也可以。2、化学方法灭菌剂使用浓度(%)持续时间（min）去除的难易效果次氯酸钙910530易很好次氯酸钠2530易很好氯化汞0.1158较难最好抗菌素450mg/L3060中较好常用灭菌剂使用浓度及效果比较表3、无菌操作技术（1）实验器具和材料的准备（2）用70%的酒精擦拭超净工作台，开净 化工作台和 室内紫外灯。（3）关紫外灯、打开风机，过510分

16、钟进入缓冲间。（4）用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具（5）进行外植体的分离与接种（6）完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手第三节 培养基组成及其成分一、植物细胞培养基的组成成分二、动物细胞培养基的组成、常用培养基类 型、常用溶液1、无机化合物 大量元素(major element) ：C、H、O、N、P、K、Ca、 Mg、S 微量元素(minor element) ：Fe、B、Zn、Cu、Mn、 Co、Mo2、有机化合物 （1）维生素：直接参与酶的形成以及蛋白质、脂肪的代谢，常用的有维生素VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、 VB3（烟酸）、 VB9(

17、叶酸)、肌醇以及维生素C(抗坏血酸)等 （2）氨基酸：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等 （3）其他有机附加物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、麦芽浸出物（ME）、酵母浸出物（YE）等一、植物细胞培养基的组成成分3、碳源和能源 常用蔗糖，作为碳源和能源，同时也可维持一定的渗透压；也可用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。 4、植物生长调节物质(Plant growth regulator)（1）生长素类(auxin)：促进细胞生长和分裂，用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，常用的有2,4-D、IAA、NAA和IBA等（2）细胞分裂素类(cytokinin)： 促进细胞分裂；诱导愈伤组织或

18、器官的分 化，常用6-BA、KT、ZT等（3）赤霉素类: 常用赤霉酸(GA3)，可促进幼苗茎的伸长生长和胚状体 发育成小植株（4）脱落酸（5）乙烯5、固化剂 常用琼脂，一般用量为0.61.0，有时可配成不加固化剂的液体培养基，进行液体浅层培养，液体培养有如下优点：低成本、生长快、移栽成活率高等。6、其他成分：活性炭、硝酸银、抗生素等（一）培养基的成分1、糖类：作为碳源和能源，主要是葡萄糖，含量一般为 1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖） 2、氨基酸：12种必需氨基酸3、维生素：包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等二、动物细胞培养基的组成、常用 培养基类型、常用溶液4、无机盐类： 大量元素包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO43-等，微量元素包括Cu2+ ，Zn2+ 和Mn2+等。 5、生长类因子及激素： 血清中含有生长因子、促进细胞贴壁的因子、矿物质、激素、脂类等，另外血清可以抑制胰酶的活性。 （二）常用培养基1、天然培养基：直接取自动物组织提取液或体液作为培养基，如血清、淋巴液、血浆凝块、水解乳蛋白、胶原等，成分复杂，来源有限2、合成培养基：常用的