研究生电镜技术

1、电镜技术基本原理及其在临床病理诊断(zhndun)中的应用共五十七页形态学领域： 宏观形态结构(jigu) (肉眼 0.2mm） (显）微观形态结构（光镜0.2mm, 0.2m） 超微形态结构（电镜 0.2m ）共五十七页第一代：光学显微镜 （17世纪发明） (The German pathologist Virchow (1821-1902 AD) 第二代：电子显微镜（透射电镜1932年； 扫描电镜1942年）第三代：扫描(somio)探针显微镜（1981年）。 共五十七页绪 论几个概念(ginin)： 电子显微镜与电子显微镜技术 正常细胞超微结构与细胞超微病理* 肿瘤细胞超微结构改变 电镜

2、技术在临床病理诊断中的应用共五十七页第一节 电子显微镜及 电子显微镜技术(jsh)电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)：以电子(dinz)束和电子(dinz)透镜组成的电子(dinz)光学系统将物体放大成像，进行细胞器 (超微结构)水平观察的大型仪器。共五十七页生物(shngw)电镜研究75年来的发展趋势1932 34 1935 1939 1942 1970 1980 1990 2000 20071959 1960 1970 1980 1993 2000 2007 国内初型设计阶段12倍1万50nm基本(jbn)定型第一批商品10万10nm原子

3、像晶格像观察0.14nm综合分析仪器第一台扫描电镜第一台透射电镜第一台扫描电镜第一台光子扫描隧道电镜共五十七页基本显微(xin wi)技术光学显微镜技术（19世纪，细胞，光源）电镜技术（20世纪30年代，细胞器，电子束） 常规电镜技术 （透射电镜及扫描电镜） 低温电镜技术： 扫描探针(tn zhn)显微镜技术（20世纪80年代，原子、纳米水平） （量子力、原子力、磁力、静电力、声学等探针扫描） 扫描隧道显微镜（STM)隧道电流 原子力显微镜 (AFM)-原子间的范德华力 光子扫描隧道显微镜(PSTM ）-物体近场的隐矢波， 活细胞共五十七页 电镜功能(gngnng)进展透射电镜细胞内部结构扫描

4、电镜细胞表面结构(jigu)扫描电镜和冷冻蚀刻立体结构免疫电镜、电镜细胞化学、电镜细胞自显影 细胞形态、功能、代谢结合电镜技术与计算机超微结构定量测量超高压电镜活细胞观察扫描探针显微镜技术测量、制造； （观察表面原子结构、制造纳米器件）共五十七页光镜与电镜的比较(bjio) LM EM光源 光束 电子束透镜(tujng) 玻璃透镜(tujng) 电磁透镜(tujng)介质 空气 高真空成像 直接、彩色 间接、黑白分辨率 约0.2m 约0.2 nm 放大倍数 1，000倍 1，000，000倍 共五十七页基本原理 成像透射电镜扫描电镜样品对照明光的吸收（直接）。电子探针扫描表面结构 ，信息拾取，

5、电子放大，荧光屏成像（间接），样品直接或处理后观察。共五十七页第一节 透射(tu sh)电子显微镜技 术共五十七页超薄切片(qi pin)的基本操作程序取材-按“早、小、轻、准”的原则，在切断血供2分 钟之内将1mm3的样品放入 固定液，注意 做好一切操作记录。前固定-4%戊二醛1-3小时 4冰箱保存(bocn)或送电镜室清洗（1）-磷酸缓冲液 1015分钟，3次。后固定-1%锇酸12小时, 4冰箱保存。清洗（2）-同清洗（1）脱水-丙酮梯度脱水：50%、70%、80%、90% 各1015分钟/次，100%10-15分钟/2次 。共五十七页超薄切片(qi pin)的基本操作程序浸透-包埋剂浸透

6、3小时（可过夜）；包埋-用包埋剂将样品包埋在胶囊或包埋板里；聚合-置烤箱：37，24小时；45，24小时； 60，24-48小时；超薄切片(qi pin)-用超薄切片机将样品切成厚约50nm 的超薄切片；电子染色-醋酸铀3040分钟，柠檬酸铅30分钟；共五十七页扫描电镜标本制备的常规程序1取材，冲洗(chngx)样品表面。2固定：3戊二醛及1丹宁酸处理3060min。3冲洗：用双蒸水冲洗样品，洗去表面的固定液。4脱水：乙醇逐级脱水，脱好水的组织块浸泡在醋酸异戊酯里。5临界点干燥：将样品放人临界干燥装置中，按照临界点干燥的方法干燥样品。6用离子溅射镀膜仪给样品的镀上金属膜。7扫描电镜观察。共五十

7、七页 扫描电镜冷冻断裂标本的制备程序1取材固定：取材按常规超薄切片技术的要求进行，组织块 的体积(tj)为lmm4nun。用l锇酸固定lh。用双蒸水冲洗数次。2二甲基亚砜浸泡：25二甲基砜浸泡30min，50二甲基 亚砜浸泡30min。3断裂：用液氮将50二甲基亚砜连同组织一起冻成一个硬 块。用冷冻过的刀片将块断裂,也可在TF一1型冷冻割断装置 中进行。将组织块放人新配制的 50二甲基亚砜里，然后 双蒸水冲洗数次。4软化和后固定：用0.1锇酸软化组织1272h，温度20 。 然后用l的锇酸固定1h。双蒸水浸洗1h，更换液体几次。5导电染色：2丹宁酸2h，双蒸水冲洗1h，换液几次，然后 再用l锇

8、酸固定3060min，双蒸水清洗1h。6脱水、干燥及镀膜，按常规方法进行。7扫描电镜观察。共五十七页免疫(miny)电镜技术操作程序(一)包埋前酶标记法1取新鲜小块组织，立即放人PLP固定液中，4固定30min。20.05molL，pH72的PBS(含有45蔗糖)4漂洗数次。3作l0 -40um的冰冻切片放人PLP固定液中，4固定6h。40.05molL，pH72的PBS(含有45蔗糖)4漂洗数次。5放人第一抗体血清作用1224h，4。6 0.05molL，pH72的PBS(苣Ufi45蔗糖)4漂洗数次。7 放人HRP标记抗体液(第二(d r)抗体)4过夜。8 005mo1L，pH72的PBS

9、(含45蔗糖)反复漂洗并过夜9DABH202显色l530min。10 005molL，PBS冲洗数次，每次1015min。111的四氧化锇固定lh，室温。 12脱水、包埋、超薄切片、复染及电镜观察。 共五十七页(二)包埋后胶体金法 1 取新鲜小块组织，立即放入PG固定液，4固定2-10h。 2PBS漂洗3次，每次30-40min。 3丙酮逐级脱水，树脂包埋，聚合。 4 作6080nm的超薄切片，置300目镍网上。 5. 在染色湿盒里的染色板上贴一层parafilm，将ll0H202液滴在 parafilm上，使之形成水珠。将有切片镍网切片朝下于水珠上蚀刻 30min以下所有步骤可按此步进行。

10、6 双蒸水洗，每次5min共5次，PBS洗，每次5min共5次， 71BSA，室温(sh wn)20min。 8吸去BSA，第一抗体作用，4 20h。 9PBS洗，每次5min，共5次。 101BSA，室温1020min。 11 吸去BSA，胶体金标记的第二抗体作用，l2h室温。 12PBS洗，每次5min，共5次。 13醋酸铀，枸橼酸铅轻度复染。 14双蒸水洗，每次5min，共5次。 15自然干燥后，电镜观察。（三）冰冻超薄切片(新鲜组织置2.3 molL蔗糖溶液，液氮速冻， 冷冻超切，免疫染色，复染观察）。共五十七页电镜观察(gunch)的优越性 电子显微镜的应用，使人类探索微观世界的能力

11、大大增强。超微病理学的发展，使人类对疾病的认识更加(gnji)深入。共五十七页电镜观察(gunch)的局限性 电镜取材(qci)要求组织块很小，可观察范围很小，只能观察到少数细胞，很难观察到组织的全貌。 对一个疾病的检查最好采用肉眼、光镜、免疫组化及电镜的过程。共五十七页动物学 植物学（微生物学(wi shn w xu)） -整体水平细胞生物学 -细胞水平 分子生物学 -分子水平 总的趋势 ：从分子水平-细胞水平 20世纪 21世纪共五十七页解放思想(ji fn s xin)刻苦钻研精益求精生物(shngw)电镜又一春共五十七页第二节、细胞(xbo)超微结构 细胞是组成人体的结构和功能(gng

12、nng)单位。利用普通的透射电镜技术、观察人体组织的超薄切片，可以看到各类细胞的细胞膜、细胞器、包含物、核膜、染色质及核仁等微细结构，通常称之为“细胞超微结构”或“亚微结构” 。 采用特殊的电镜技术，如电镜细胞化学与免疫电镜技术，可以进一步观察确定细胞内某些抗原、抗体、受体及化学物质的性质、分布及数量 。共五十七页超微病理学 ( ultrastructural pathology )概念：利用电镜技术，观察病变细胞的超微结构 变化，进行亚细胞水平的病理形态学研究的 一门学科。研究内容：研究细胞在病理状态下出现的各种超微 结构的改变，主要是应用电子显微镜观察 细胞器，大分子及其生化代谢的改变，并

13、 分析各病变间的联系及因果关系意义：这门学科的形成，将进一步促进(cjn)电镜技术在 临床诊断方面的广泛应用。 共五十七页一、细胞膜及其特化物1细胞膜(cell membrane) ：包裹细胞表面的薄膜， 切面呈线状围绕细胞。细胞膜垂直切面，在高倍镜下呈三层结构，两深一浅，即所称单位膜 (unit membrane)。（主要成分脂质、蛋白、少量糖类(tn li)等） 2细胞外衣(cell coat) ：为细胞膜外的丝网状结构 3微绒毛(microvillus) 细胞游离面细胞膜与细胞质 伸出的指状突起，中心为细胞质 。 肠型微绒毛：中心由微丝束组成轴心。共五十七页4纤毛(cilia) : 上皮

14、细胞顶端伸出的能动的细长(x chn)突起， 由细胞膜包绕微管复合结构，称为纤毛。其横剖面可见9+2微管结构，即中心2个单微管，周边9组双微管及臂。共五十七页5细胞连接(cell junction) 在上皮组织细胞间或极少数间叶 组织细胞间可见细胞连接。连接可分为以下数种。 (1)桥粒(desmosome)：呈斑状，由细胞间高电子密度中线 和胞质面的附着板组成。广泛存在于鳞状上皮细胞 、 腺细胞或柱状细胞间。在上皮细胞基底面，细胞膜 与基板相邻处可见半桥粒 。 (2)中间连接（intermetiate)： 位于紧密连接下方的连续的 桥粒状粘着小带。 (3)紧密连接(tight junction

15、)： 柱状上皮、腺上皮或内皮细 胞间，近腔侧相临细胞膜形成(xngchng)的连续性紧密接触区带 。 (4)复合连接(junctional complex)： 在柱状上皮细胞间可 见由紧密连接、中间连接及桥粒组成的复合连接 。 一、细胞膜及其特化物共五十七页6基板(basal lamina) 上皮细胞或内皮细胞 基底面细胞膜邻近，可见由无定形物质构成 一层膜样物质，称之为基板 。7胞饮小泡(pinosome) 胞饮小泡为细胞膜下陷 形成的含有液态(yti)物质的小泡，有运输作用， 以血管内皮细胞多见 。一、细胞膜及其特化物共五十七页二、细胞核(nucleus) 1核膜(nuclear memb

16、rane) 核膜由核内膜、核外膜、 核周隙及核孔组成。 2染色质(chromatin) 为细胞遗传有关物质，可分为 常染色质：电子密度低， DNA复制及转录功能旺盛； 异染色质：电子密度高，DNA功能呈静止状态； 染色质间颗粒：核内染色质，呈多个聚集； 染色质周颗粒(perichromatin granule)：核膜邻近染色质， 常单个存在(cnzi)；两种颗粒周围均有空晕。 3核仁(nucleolus) ：由核仁丝及核仁基质组成， 与蛋白质合成功能有关。 核仁丝由原纤维状及颗粒状结构组成。共五十七页三、细胞质内各细胞器(organelles in cytoplasm ) 1线粒体(mitoc

17、hondria) ： 由双层膜构成的线状或粒状小体。细胞内合成ATP的主要场所，由外膜、内膜、外腔、内腔、嵴及基质组成。 板层状嵴：多数线粒体的嵴与长轴垂直(chuzh)， 呈层状； 管泡状嵴：嵴呈管泡状，与甾类物质合成 有关 。 共五十七页2核糖体(ribosome) ： 蛋白质与核糖核酸组成的致密颗粒(kl)，无膜包饶。 与蛋白质合成功能有关。 多聚核糖体：多个核糖体聚集在一条mRNA连上； 游离核糖体：分散于细胞质中； 膜旁核糖体：附着在内质网膜的胞质面。共五十七页3粗面内质网(rough endoplasmic reticulum，RER) 表面附着核糖体膜状细胞器呈扁囊状或 管泡状，

18、与分泌性蛋白质合成有关。 扁池：由彼此相通呈网状的膜组成； 膜旁有核糖体： 单个或少数分散存在(cnzi) ，或多个呈板层状排列。三、细胞质内各细胞器(organelles in cytoplasm )共五十七页4滑面内质网(smooth endoplasmic reticulum，SER) 无核糖体附着膜状细胞器，呈分支管状或小泡状，与甾类物质(wzh)的代谢有关。 在肝细胞及内分泌细胞中多见，。共五十七页5高尔基体(Golgi apparatus) 由三种基本膜性成分组成，与细胞分泌 功能有关(yugun)。 大泡：位于凹面（分泌面），成熟的分泌泡； 小泡：位于凸面（形成面），运输小泡；扁

19、池： 3-8层扁平囊，长弓形平行排列。三、细胞质内各细胞器(organelles in cytoplasm )共五十七页6溶酶体(1ysosome) ： 含有酸性(sun xn)水解酶的一组膜性细胞器。 初级溶酶体：有膜包绕的小泡，内有不同 类型的酶； 次级溶酶体：已与底物发生作用，内有酶、 作用底物及消化产物，外形及 内在电子密度不一。 脂褐素(1ipofuscin)： 溶酶体作用未消化 尽的物质, 是一种残质体，在衰 老或萎缩的细胞中出现。共五十七页7微管(microtubule)： 细胞骨架中蛋白性微小 中空管状结构，不稳定， 可不断解聚和聚合。 单微管：直径约25 nm，如核分裂时的纺

20、锤丝； 双微管：如纤毛周边有9组双微管； 三联微管：见于中心粒。 微丝（microfilament): 伸展型蛋白分子，根据直径分： 细微(xwi)丝、粗微丝：肌细胞 中间丝：上皮细胞；神经细胞和神经胶质细胞三、细胞质内各细胞器(organelles in cytoplasm )共五十七页中心粒(centrosome) ： 细胞骨架中成对的圆桶状小体。 桶壁由9组纵行的三联管构成(guchng)。 可构成细胞分裂时纺锤体的两个极， 与纺锤体、纤毛和鞭毛运动有关 。共五十七页第三节 肿瘤(zhngli)细胞超微结构特点共五十七页肿瘤(zhngli)是一种常见病肿瘤死因排序：2001年 2003年

21、 近年来肿瘤的概念：肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的某一细胞在基因水平上失去对其生长的控制，导致其克隆性异常增生而形成的新生物（neoplasm)，常表现(bioxin)为局部肿块。共五十七页肿瘤(zhngli)的几个特点：肿瘤的本质：基因水平的异常； 克隆性增生； 遗传特性改变肿瘤的异常：形态、代谢、功能、 良、恶性( xng)不同于炎症增生：共五十七页病理学研究肿瘤(zhngli)的一般形态特征肉眼：光镜下：分化(fnhu) 异性性电镜下：同型性 异型性 作用（1） （2）共五十七页一、恶性肿瘤( xng zhng li)细胞超微结构一般特征(General characteri

22、stics of ultrastructure of cancer cell) （一）与蛋白质合成有关的结构十分发达 恶性肿瘤生长迅速，蛋白质合成功能十分旺盛。蛋白质合成与染色质、核仁、核内外物质交换及多聚核糖体等结构的功能状态有关。恶性肿瘤细胞内蛋白质合成功能旺盛，在超微结构上可显示出以下(yxi)特点：共五十七页1核大 准确地讲是核一质比例增大，也就是核径与细胞质 径之比等于l或大于1。恶性瘤细胞核增大是与相应 正常细胞相比较，核径绝对值增大。恶性肿瘤除少 数例外，均有此特点。2常染色质明显 癌细胞核内常染色质十分明显，说明 DNA复制及转录功能处于活跃状态。异染色质也 可见到，常小块分散

23、于核中或在核膜邻近处 。3核仁肥大 核仁内有核糖体的前体物质。恶性肿瘤细胞中， 核仁不仅肥大，并可有多种形态。其位置也有变化， 可紧贴核膜，称核仁边集（nuclear margination)。核 仁数目亦可增多，有时可有两个或两个以上的核仁 。4核小体明显 核小体是由大量微丝盘绕而成的圆形小体， 肿瘤时出现率增高，体积大，形态多样(du yn) 。5其他 细胞质内多聚核糖体或粗面内质网常十分丰富 共五十七页（二）异型性1核形态异常 (1)核形状怪异，核膜曲折起伏，外形不规则， 可出现核内假包含(bohn)体、核袋、核突等改变； (2)瘤巨细胞中可出现巨形核、分叶核及多核； (3)病理性核分裂

24、， 可出现染色体不对称或 多极的核分裂。2细胞外形异常及排列紊乱 (1)瘤细胞大小、形状差异较大，可出现在各种 不同分化程度的肿瘤中； (2)恶性肿瘤内瘤细胞排列杂乱，极向丧失。 共五十七页（二）异型性3细胞器形态异常 (1)微绒毛：瘤细胞表面微绒毛可出现方向杂乱， 长短、粗细不一。 (2)细胞连接(linji)：桥粒在癌细胞间减少，也可异常 增多，或成串出现，形成巨形桥粒。 (3)线粒体：线粒体形态异常，如细长、圈状， 嵴与线粒体长轴平行，或出现巨形线粒体等。 (4)粗面内质网：粗面内质网呈同心圆排列，即 同心圆膜性小体，指纹样排列或呈池内隔离。共五十七页（三）低分化(fnhu) 可出现低分

25、化或未分化的癌瘤细胞，类似胚胎(piti)发育中的细胞 。共五十七页（四）异常(ychng)分化异常分化包括异质性、不同步性，以及来源不明分化。 1多相性分化或异质性分化(heterogeneous differentiation) 在一个肿瘤细胞内出现两种或两种以上细胞 类型的分化双相分化：其中最常见的是腺鳞双相分化，表现为 一个癌细胞内既有鳞癌的特点，也有腺癌的特点。 可以是黏液癌与神经(shnjng)内分泌癌的； 三相性分化：如鳞、腺及神经内分泌。可发生在多种部位：如鼻咽癌、肺癌、胃癌、肠癌 及子宫颈癌；共五十七页（四）异常(ychng)分化2不同步分化(unsynchronous di

26、fferentiation) 在同一肿瘤细胞内各种细胞器或各结构成分分 化程度不一致。最常见的是细胞问连接(linji)分化差， 少而幼稚，而细胞质内细胞结构分化较好。再 如慢性粒细胞白血病，肿瘤细胞内核已明显成 熟分叶，但细胞质内颗粒无或很。3来源不明的分化 肿瘤细胞虽表现出一定分化， 但从细胞结构仍不能辨认出此种肿瘤细胞的组 织来源，例如腺泡状软组织肉瘤、上皮样肉瘤、 横纹肌样瘤及软节原纤维软组织肿瘤等。共五十七页（五）浸润性生长(shngzhng)、破坏正常细胞1.浸润 恶性肿瘤细胞可伸出假足突破基板或 周围基质进入问质，或完全与瘤组织块分离， 单个或多个瘤细胞游离于间质中。2.侵入淋巴

27、管或血管 恶性肿瘤细胞侵入局部淋巴管， 也可侵入小血管。3.损伤 不论是原发性恶性肿瘤或转移性恶性肿瘤， 在其浸润性生长过程中，可以损伤机体各种正 常组织，包括肌肉(jru)、血管及神经等。共五十七页二、电镜观察(gunch)在肿瘤鉴别诊断中的具体应用同形性：多数肿瘤仍保持了起源组织细胞超微结构 特异性，此特性称同形性。 异型性：肿瘤细胞超微结构与起源组织存在不同程度 的差异(chy)，这种差异(chy)称异型性。应用： 根据同形性寻找肿瘤的起源，进行肿瘤的 诊断与鉴别诊断。 根据异型性分析分化程度、功能状态、 推测预后；共五十七页举例： 低分化(fnhu)癌与低分化(fnhu)肉瘤； 低分化鳞癌与低分化腺癌； 低分化腺癌与类癌； 低分化癌（或未分化癌）与少色素性 黑色素瘤等共五十七页（一）低分化癌与肉瘤(ruli)的区别癌(carcinoma)： 细胞间有细胞连接，如桥粒、紧密连接或复合连接； 细胞腔面有微绒毛； 细胞内可见微小腺腔； 细胞间无胶原纤维，癌细胞团与相邻间质交界处 有时可见基板和间质分开。肉瘤(sarcoma)： 细胞间一般无细胞连接，特别是看不到典型的桥粒 或复合连接；但滑膜肉瘤细胞间有桥粒样结构； 瘤细胞比较分散；