水草组织培养实验室布局以及基本技术

1、关于水草组织培养实验室的布局及基本技术第一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 组织培养实验室布局的总体要求便于隔离便于操作便于灭菌便于观察第一节 实验室设置及基本技术第二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月基本实验室辅助实验室一、实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室第三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁 架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室第四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月组织培养准备

2、实验室第五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月缓冲室第六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月培养室第七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月无菌室（一）第八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月无菌室（二）第九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月二、仪器设备1、基本仪器设备 冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。第十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月冰箱酸度计电炉第十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月天平纯水器第十二张，PPT共一百九十五页，创作于20

3、22年6月培养基分装器搅拌器第十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。第十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月蒸汽压力灭菌锅第十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月干热消毒柜第十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月无菌瓶顶过滤装置喷雾消毒器第十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月3、无菌操作设备 超净工作台第十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月无菌接种箱第十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月4、细胞培养设备 摇 床第二十张，PPT共一

4、百九十五页，创作于2022年6月培养架第二十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月HZC-250恒温振荡培养箱 150C250D光照培养箱 第二十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月5、细胞学鉴定设备 光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜第二十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶第二十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、金属材质用具镊子解剖刀接种针第二十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清

5、水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿第二十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用第二十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月3、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干第二十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月五、灭菌技术物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、过滤除菌等化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法第二十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在9.810410.8104P

6、a 温度在121 灭菌2030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌第三十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力温度（）饱和蒸汽压力温度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6第三十

7、一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（3）塑料器皿灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用第三十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（5）接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净工作台紫外灯照射70%75%的酒精擦洗培养材料的接种紫外灯照射第三十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（6）外植体灭菌流水冲洗1020min或更长时间70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗4-5次在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右备用第三十四张，PPT共一百九十五页

8、，创作于2022年6月常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9102饱和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易较难易中较难5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较好好第三十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月六、无菌操作实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材的灭菌无菌接种消 毒实验台卫生培养室培养第三十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外

9、灯，照射40min左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。第三十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月5、用沾有70%75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。第三十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。注意：操

10、作期间应经常用70%75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。第三十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第二节培养基的成分与配制技术 一、环境条件 与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。第四十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月温度光照湿度气体渗透压pH值一般最适温度在252之间环境条件最常用的是光照16h，黑暗8h 一般情况下

11、，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%80% 氧气是愈伤组织生长所必需的 调节渗透压常常从糖入手 培养基的pH值大多在5.06.5，5.8第四十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月二、营养成分 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡点等化学方面的作用；发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。第四十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月Arnon和S

12、tout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准:阿隆和斯托德 A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史;B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复;C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。第四十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。第四十四张，PPT共一百

13、九十五页，创作于2022年6月根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素第四十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 NaH2PO4等

14、。 K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。1、大量元素第四十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。第四十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、微量元素 在微量元素中，铁的使用最大： 一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀第四十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 硼与蛋

15、白质合成、糖类运输有着密切的关系。 铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长。 锰参与植物的光合、呼吸代谢。 钼参与氮素的代谢。 氯是光合作用水光解的活化剂。 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。第四十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。 桃树第五十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第五十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第五十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第五十三张，PPT共一百九十五页

16、，创作于2022年6月第五十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第五十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月缺铜症状： 新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，其下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。 菊花第五十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第五十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第五十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月缺锰症状： 叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。 菜豆第五十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月梨缺锰症第六十张，PPT

17、共一百九十五页，创作于2022年6月第六十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月缺钼症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。 白菜第六十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第六十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月缺硼症状：受精不良，籽粒减少 ，“花而不实”， “蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。 马铃薯第六十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第六十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月缺锌症状： 小叶病，叶片变小，两节之间缩短。

18、叶脉间失去绿色或者变白。第六十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月植物缺素症缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象；缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死；缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的节间变短；缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心；缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫；第六十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月青岛农业大学海洋科学与工程学院缺锰：新叶脉间失绿；缺铁：叶片黄，叶脉绿；缺硼：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝；缺锌：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑；缺铜：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落；缺钼：不能形成花器

19、或花早落。 第六十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月3、碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。 糖类物质特点： 具有遇热易变 利于吸收和利用 使用浓度一般在2%-5% 提供能源和调节渗透压第六十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 4、维生素类 以各种辅酶的形式存在 参与多种代谢活动 对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素 常用维生素有VB1和VB6 第七十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 5、肌醇 环己六醇 细胞壁的构建材料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动 促进活性物质发挥作用第七十一

20、张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月蛋白质的组成成分 有机氮源 可直接被细胞吸收利用培养基中常用的是甘氨酸6、氨基酸第七十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂 天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物7、天然复合物第七十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月8、琼脂 是使用最普遍的凝固剂用量一般在6-10g/L之间颜色以浅、透明度高的好，洁净为上品 除了琼脂外，在组织培养中还可以使用卡拉胶、琼脂糖、结冷胶等。第七十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月9、活性炭 吸附培养基及培养物分泌物中的抑制

21、物质 抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生 促进培养物生长和分化 促进生根10、抗生素 防止外植体内生菌造成的污染活性炭第七十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生长素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)11、生长素类 第七十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的形成 延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成 用于离

22、体成花的调控 溶于0.5-1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素： KT (激动素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素12、细胞分裂素类 第七十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 A、赤霉素类 组织培养中不常使用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、脱落酸(ABA) 抑制细胞分裂和伸长 促进脱落和衰老 促进休眠和提高抗逆能力13、赤霉素类和脱落酸第七十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月培养基形态不同：固体培养基、液体培养基培养过程不同：初代培养基、继代培养基其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基

23、营养水平不同：基本培养基、完全培养基一、培养基的种类第三节 培养基灭菌技术及培养条件第七十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月1、MS培养基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需要添加更多的有机附加物二、几种常见培养基的特点第八十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第八十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、White培养基 1943年由White为培养番茄根尖而设计。 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低 使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果。第八十二张，PPT共一百九十五页

24、，创作于2022年6月大量元素含量微量元素含量铁盐含量有机物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0烟酸0.3琼脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培养基第八十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月3、B5培养基 1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸

25、盐和盐酸硫胺素第八十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月组成成分 数量(mg/l）组成成分 数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵素 10 Na2-EDTA37.3 B5培养基

26、的组成和配方第八十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月4、N6培养基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KNO3和（NH4）SO4含量高，不含钼第八十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月组成成分 数量(mg/l) 组成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵

27、 1.0 ZnSO47H2O 1.5N6培养基组成及配方第八十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月配制培养基应做好几点工作：1、实验用具的准备。包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和准备。2、试剂、药品的准备3、根据培养基的配方、母液扩大倍数及需要配制的培养基体积计算所需各种母液及其他附加物的量。三、培养基的配制第八十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第八十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月具体操作如下：1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；2、根据计算所需量依次加入大量元素、微

28、量元素、铁盐、有机物、生长调节物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀；3、加水定容至规定体积，搅拌均匀；4、调整培养基的pH值；5、分装（倒）；6、封口（拧盖）。第九十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 培养基分装封口后立刻进行灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。 一般采用的是高压蒸汽灭菌。四、培养基的灭菌第九十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第九十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流

29、动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌效果；第九十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。第九十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月高压灭菌的原理 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 第九十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月

30、注意事项 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时,开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。 第九十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每

31、1克水在100时，由气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 第九十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月青岛农业大学海洋科学与工程学院在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 第九十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 灭菌后的培

32、养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。 检验方法： 将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。 保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。 保存时间不可过长。五、培养基的保存第九十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第一百张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第四节 外植体的选择和灭菌 一、 外植体的选择 二、 外植体的灭菌方法 三、 污染原因和预防措施 第一百零一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月一、外植体的选择 植物组织培养的主要过程大致包括：外植体的选择、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。 1、选择优良

33、的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。 第一百零二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。3、选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。第一百零三张，PP

34、T共一百九十五页，创作于2022年6月4、选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。第一百零四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月二、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果2、外植体的灭菌方法第一百零五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月1、常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效 果次氯酸钙910易530很好次氯酸钠2易530很好漂 白 粉饱和浓度易530很好氯 化

35、 汞0.11较难210最好酒 精7075易0.22好过氧化氢1012最易515好溴 水12易210很好硝 酸 银1较难530好抗 菌 素450mg/L中3060较好第一百零六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处理。植物材料一般采取的预处理方法是：先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。 第一百零七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月常规的表面灭菌处理方法把材料放进70%的酒精中约30s。用0.1%的升

36、汞（HgCl2）浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 15min。无菌蒸馏水冲洗35次。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温） 或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。 第一百零八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月三、污染原因和预防措施1、污染的原因污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。污染的原因：从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。第一百零九张，PPT共一百九十五页，

37、创作于2022年6月细菌污染的特点：是在材料附近的培养基中出现浑浊和云雾状痕迹。一般在接种后12天即可发现。原因：材料带菌； 培养基灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程。因此接种人员的手应经常用70%酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。第一百一十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月真菌污染的特点：培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝块。在接种后310天才能发现。原因：周围环境不清洁； 超净工作台的过滤装置失效； 培养瓶等器皿的口径过大。为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。 第一百一十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月

38、2、污染的预防措施发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施:第一百一十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月1）防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。枝条 水洗净 插入无糖的营养液或自来水 抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待 抽出徒长的黄化枝条

39、时采枝，经灭菌后接种也可明 显减少污染。 第一百一十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 （2）选择合适的时间去田间采取外植体避免阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。第一百一十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。第一百一十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月2）外植体的灭菌（1）多次灭菌法： 首先除去主脉（因主脉与支脉交

40、界处常有真菌休眠孢子存在）； 其次，将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中，灭菌30min； 第三，在无菌蒸馏水中冲洗3-5次； 第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度； 第五，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后用蒸馏水洗3-5次。第一百一十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（2）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料：首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；第2，将材料放入70%酒精中灭菌数秒钟；第3，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5

41、min；第4，放入5%10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌510min；第5，用无菌水冲洗5次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1M盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 第一百一十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月3）玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min30min。干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。第一百一十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月4）金属器

42、械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。干热灭菌法：即将擦洗干净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。第一百一十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，121C的温度，灭菌20 min30min。5）布质制品的灭菌 第一百二十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月6）无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔灭或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20-30m

43、in。使用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。第一百二十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行第一百二十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min，后用70%的酒精擦手，并用70%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，

44、或不慎感染杂菌。 第一百二十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月小 结第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适的时期、适宜的大小。 第二节 外植体的灭菌方法：9种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外植体的灭菌方法。第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。 第一百二十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月第五节 外植体的接种和培养 一、 外植体的接种 二、 培养条件第一百二十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年

45、6月 一、外植体的接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作过程。 操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。整个接种过程均须无菌操作：第一百二十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月1操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果, 进行操作前再用70%的酒精擦洗双手。2操作期间经常用70%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递”的污染，例如器械被手污染

46、后又污染培养基等。第一百二十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月3在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。第一百二十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月4工具用后及时消毒，避免交叉污染。5工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。第一百二十九张，PPT共一百九

47、十五页，创作于2022年6月6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。 第一百三十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月二、外植体的培养条件 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。第一百三十一张，PPT共一百

48、九十五页，创作于2022年6月1、光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。第一百三十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 2温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生

49、长温度，大多数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所用的温度是25C2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。第一百三十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 3湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内保持70%-80%的相对湿度。第一百三十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月4氧气 植物组织培养中，外植体的呼

50、吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。第一百三十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月葡萄嫩茎接种48h马铃薯茎尖接种40d三、外植体的褐变及其预防措施第一百三十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 褐变：是指外植体在培养过程中自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也进一步变褐而死亡的现象。（一）褐变的概念第一百三十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关系。酚类很不稳定，溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水

51、，醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不前，最终衰老死亡。 （二）褐变的原因第一百三十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 植物材料不同，褐变的程度有所不同。（三）影响褐变的因素枣蝴蝶兰苹果环境、培养基、转接周期不同，褐变的程度不同。第一百三十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月1、植物材料（1）基因型 不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物（木质素）、单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变。这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁

52、和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、单宁或色素形成就多，而酚类化合物含量高将导致褐变的发生，因此，木本植物一般比草本植物容易发生褐变。第一百四十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月苹 果苜 蓿第一百四十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 （2）材料年龄 幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。Chever 分析欧洲栗的酚类含量变化的结果表明，幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。平吉成从山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进行培养，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。第一百四十二张

53、，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月梨一年生枝、二年生枝接种3d第一百四十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（3）取材部位 Yu和Meredith在葡萄上发现从侧生蔓切取茎尖进行培养，比从延长蔓切取的茎尖更容易成活，进一步分析酚类含量发现前者比后者少。而苹果则顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。第一百四十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 （4）取材时期 多酚氧化酶活性和酚类含量基本是对应的，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有人认为取材时期比取材部位更加重要。Chever报道，欧洲栗在3月15

54、日-30日醌类物质形成少，而在5月-6月醌类物质明显提高。 第一百四十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重,当茎尖长度在5mm-15mm时褐变较轻,成活率可达85%。在多个苹果品种上试验结果表明，用5mm-10mm长的茎尖进行培养效果最好，茎尖如果太小很容易发生褐变。另外，取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。 （5）外植体大小第一百四十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月 主要是光照与温度。温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。2、培养条件第一百四十七张，PPT共一百九十五页，创作

55、于2022年6月 （1）培养基状态 由于培养基中琼脂的用量和pH值的高低不同，培养基可配成固体培养基、半固体培养基或液体培养基。许多试验证明，液体培养基可以有效克服外植体褐变，液体培养基再加上滤纸桥，效果就更好。在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。3、培养基第一百四十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（2）无机盐 在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。原因是无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子，因此盐浓度过高会增加这些酶的活性，酶又进一步促进酚类合成与氧化

56、。 第一百四十九张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（3）植物生长调节物质 初代培养处在黑暗条件下，生长调节物质的存在是影响褐变的主要原因，此时去除生长调节物质可减轻褐变。细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性，这一现象在甘蔗的组织培养中明显。而生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。 第一百五十张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（4）抗氧化剂 培养基中加入抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。 第一百五十一张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（5）吸附剂 活性炭

57、和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应，这在东北红豆杉、猪笼草、鹤望兰、杜鹃花、苹果、桃和倒挂金钟等植物上都有过报道。在倒挂金钟茎尖培养中只加入0.01%PVP便对褐变有抑制作用。 第一百五十二张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（6）pH值 培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。而pH值升高则明显加重褐变。第一百五十三张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月4、材料转瓶周期 对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。而缩短转瓶周期可减轻褐变。在山月桂树的茎尖培养中，接种后1

58、2h24h，便转入液体培养基中，这之后的一周内，每天转一次瓶，褐变得到完全控制。在无刺黑莓上也有类似经验 。第一百五十四张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月（四）褐变的预防措施1选择适宜的外植体 外植体应选择分生能力较强的材料。如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。2采用适宜的培养基和光温条件 培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d40d，可以显著减轻材料的褐变。 第一百五十五张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月3在培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂 在培养基中加入0.1%0.5%

59、的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。如在培养基中加抗坏血酸、血清白蛋白、有机酸、蛋白质、氨基酸等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进行材料的预处理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。4缩短转瓶周期 这是组培中控制褐变常用且有效的方法。第一百五十六张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月青岛农业大学海洋科学与工程学院四、玻璃化现象 是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋

60、白质、纤维素和木质素含量低的现象。 第一百五十七张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月青岛农业大学海洋科学与工程学院（一）玻璃化苗的危害性 由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。第一百五十八张，PPT共一百九十五页，创作于2022年6月青岛农业大学海洋科学与工程学院（二）玻璃化的原因 玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。 产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。第一百五十九张，PPT共一百九十五页，创作于202