孕前遗传学理论和实验室基本流程及临床意义

1、孕前遗传学理论和实验室基本流程及临床意义 医学遗传学实验围绕人外周血染色体制备、SCE观察分析、性状调查及皮纹分析等方面的工作，在掌握基本的实验方法及技能同时引导学生制定实验路线。在实验中有意识地培养同学们规范操作、仔细观察和收集数据、科学的归纳分析等严谨、实事求是的科学素养。人外周血淋巴细胞染色体标本制备实验一实验目的实验原理实验试剂与仪器实验步骤注意事项结果分析作业及思考题了解人类外周血淋巴细胞的培养方法。熟悉人类染色体的基本形态特点。掌握染色体标本的制备方法。一、实验目的 二、实验原理 外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素（phy

2、tohemagglutinin, PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经过短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察。这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。在人类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法获取分裂的细胞，进而开展临床和基础遗传学的研究。这对于遗传疾病的检出以及遗传咨询等工作发挥了重要作用。 抽滤器、恒温水浴箱、离心机培养瓶、注射器、移液管、量筒RPMI1640、小牛血清、NaHCO3、生理盐水、肝素、1.0g/L秋水仙素溶液、低渗液（0.025M KCl）、固定液三

3、、实验试剂及仪器 1. 植物血凝素 (PHA ) 刺激外周血淋巴细胞从G0期返回正常细胞周期。2. 秋水仙素 阻止微管组装。 中期染色体无法排列赤道板。 抑制姐妹染色体的分离，将细胞停留在中期。 目的 : 获得大量的中期细胞。 3. 固定剂 新配置的甲醇 & 冰醋酸混合液 (3:1)。4. 染料 Giemsa。四、实验步骤 培养液4ml小牛血清1ml全血培养72小时每ml培养液加1ug继续培养3-5小时培养秋水仙素培养瓶取样 取1ml培养液于10ml离心管1.1000rpm离心5分钟弃上清离心2.加KCl 5ml混匀37处理20分钟低渗3.离心（同前）制片预冷冰片距离20cm以上玻片倾斜30迅

4、速吹气过火焰3-5次7.8.9.空 气干燥Giemsa染色10min细水流冲洗染色10.11.12.吹干镜检13.14.1) 离心机平衡： 离心管的重量平衡； 离心管偶数、对称放置2) 细心、温柔混匀沉淀；3) 冰、湿玻片；4) 确定将材料滴在玻片上；5) 不能烘烤!五、注意事项 六、结果分析 人中期细胞染色体（2N=46） 七、作业及思考题1. 观察人类染色体的形态、结构特点。2. 总结做好本实验的关键因素。核型分析及SCE观察实验二实验目的实验原理实验材料实验步骤注意事项作业与讨论 一、实验目的掌握染色体组型分析的各种数据指标学习染色体组型分析的基本方法掌握SCE（姐妹染色单体互换）形成的

5、原理和方法熟悉SCE计数方法并对实验结果进行显著性测验。二、实验原理定义：染色体组型又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。核型模式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。在DNA复制过程中，加入外源的5-溴脱氧尿苷(BrdU)使DNA双链的化学组成形成差别，经过分化染色处理，导致2条姐妹染色单体呈现深浅不同的色差。染色体的特征数目 （2n=46）长度（绝对长度、相对长度）着丝粒位置 （MSMSTT）随体与次溢痕的数目、大小和位置带型分析应用意义染色体

6、组型分析染色体水平上的表型识别单条染色体、基因定位临床应用（染色体疾病、产前诊断）人类23对染色体三、试验材料毫米尺、剪刀、胶水、计算器、白纸人染色体放大照片组型分析实验方法染色体数目确定染色体形态特征： 长度：绝对、相对 相对长度=每条染色体的长度/全套染色体长度 臂比=长臂/短臂 着丝点指数=短臂/（长+短臂） 随体的有无分组排队原则1. 着丝粒类型相同，相对长度相近的分一组；2. 同一组的按染色体长短顺序配对排列；3. 各指数相同的染色体配为一对；4. 可根据随体的有无进行配对；5. 将染色体按长短排队，短臂向上。四、实验步骤1. 计数，沿边缘剪下染色体，编号；2. 初步目测配对，分组；

7、3. 测量长度，计算相对长度、着丝粒指数、臂比，相同的染色体间配对；4. 将配对好的染色体排列并粘贴在纸上，每一组下面画一横线，在两端注明起止号，并在横线下的中部写明A-G组号，染色体从大到小编为1-22号，性染色体单独列为一组。五、注意事项观察细胞的标准为：1. 细胞形态完整、轮廓清晰。2. 染色体形态和分散良好。3. 在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。4. 油镜使用完后要及时清洁镜头。结果分析作业与讨论1. 制作核型分析板作出书面报告。2. 统计分析SCE交换率。 人类某些遗传性状调查实验三 人类单基因遗传的性状或疾病在上下代之间的传递遵循孟德尔定律，在一个

8、大的群体中，通过调查分析这些性状，可以对该群体的某一基因频率及基因型频率做出估计；另外某些性状在临床诊断上可以做为遗传病的诊断参考。 较为常见的单基因遗传性状有：苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）尝味、ABO血型、眼睑的单与双、耳垂的有或无、能卷舌和不能卷舌及额前发际的形状等，均属于单基因控制的性状。一、PTC尝味实验1实验目的 （1）了解PTC尝味实验的基本原理 （2）掌握PTC尝味实验的基本操作 PTC是一种白色结晶状药物，由于其含有NC=S基团而有苦涩味，但对人无毒副作用；不同种族、民族和个体之间，对该物质的尝味能考不同；人体对苯硫脲的尝味能力是由一对等位基因(Tt

9、)所控制的性状，T对t为不完全显性。2实验原理3实验内容器材：试管、试管架、滴管。试剂PTC溶液的配制：配制PTC原液，浓度约为1750。PTC尝味使用液配制：将PTC原液编为1号液，将1号液用蒸馏水稀释1倍编为2号液，将2号液再稀释一倍编为3号液，以此类推，直至配成14号PTC溶液，14号液浓度为16 000 000，将配好的14种不同浓度的PTC溶液分别置于消毒好的白色试剂瓶内。(1)器材和试剂让受试者坐在椅子上，仰头张嘴，用滴管滴510滴14号液于舌根部，让受试者徐徐下咽品味，并用蒸馏水作对照试验。（2）操作步骤询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道，若不能鉴别或不能断定，则依次用13号、1

10、2号溶液重复试验(应注意与蒸馏水交替测试)，直到明确鉴别出PTC的苦味为止。tt基因型的阈值范围为16号液，Tt基因型的阈值范围为710号液，TT基因型的阈值范围为1114号液。为简化操作程序，也可只用6，7，10，11和13号五种溶液进行测试，尝不出6号苦味者为tt基因型，尝出7号和10号液的苦味者为Tt基因型，尝出11号者为TT基因型。统计所测人员的测试结果，按HardyWeinberg定律计算出所测人群中的PTC尝味基因的基因型频率和基因频率。PTC溶液浓度，个体基因型与个体表型的关系 人类对PTC尝味能力属于不完全显性遗传(半显性遗传),而且已知纯合体味盲（tt）容易患结节性甲状腺肿，

11、因此可以把PTC的尝味能力，作为一种辅助性诊断指标。我国汉族人群中，PTC味盲约占10。小结二 、 ABO血型检测（1）了解决定ABO血型的等位基因（2）掌握抗原抗体反应检测ABO血型的原理和方法1.实验目的2实验原理 血型是人体的遗传性状，基本的血型系统有16种之多，ABO血型是红细胞血型系统中的一种；它受一组复等位基因(IA、IB、i)控制。人类的红细胞表面有A和B两种抗原，血清中有抗B()和抗A()两种天然抗体，依抗原和抗体存在的情况，可将人类的血型分为A，B，AB和O四种血型。 一种血液中红细胞在A型标准血清中发生凝集者为B型，在B型标准血清中凝集者为A型，在两种标准血清中都凝集者为A

12、B型，在两种标准血清中都不凝集者为O型。3实验内容器材：显微镜、双凹玻片或普通载玻片、采血针、青霉素小瓶、胶布、记号笔、牙签或小玻棒、棉球、小镜子。试剂：A型(抗B)和B型(抗A)标准血清、70酒精、O.9生理盐水。(1)器材和试剂(2)操作步骤取一清洁的双凹玻片(或用普通载玻片用玻璃蜡笔划出方格代替)，两端上角分别用记号笔或胶布注明A和B及受试者姓名，然后分别用吸管吸取A和B型标准血清各一滴，滴人相应凹格(或方格)内。用70酒精棉球消毒受试者的耳垂或指端，待酒精干后，用无菌的采血针刺破皮肤，用吸管取12滴血放入盛有0.30.5 ml生理盐水的青霉素小瓶中，用吸管轻轻吹打成约5的红细胞生理盐水

13、悬液。 在玻片的每一凹格(或方格)内分别滴一滴制好的红细胞悬液(注意滴管不要触及标准血清)，然后立即用牙签或小玻棒分别搅拌液体，使血球和标准血清充分混匀。在室温下每隔数分钟轻轻晃动玻片几次，以加速凝集，等1030 min后观察有无凝集现象。若混匀的血清由混浊变为透明，出现大小不等的红色颗粒，表示红细胞已凝集。若仍呈混浊状，无颗粒出现，则表明无凝集现象；若观察不清可用显微镜在低倍镜下观察；若室温过高，可将玻片放于加有湿棉花的培养皿中，以防干涸；室温过低可将玻片置于37恒温箱中，以促其凝集。表一 ABO血型的凝集反应和基因型根据ABO血型检查结果，判断自己及受检者的血型。注意事项：标准血清必须有效

14、；红细胞悬液不宜过浓或过稀；反应时间及温度要适中，应注意辨别假阴性和假阳性。 一般实验室常用的方法有试管法与玻片法。试管法的优点是敏感，较少发生假凝集；玻片法则简便易行，但玻片法如控制不好，易发生不规则的凝集现象;本实验用玻片法。三、 常规性状的调查部分人能够卷舌：舌的两侧能够在口腔中向上卷成槽行，甚至卷成筒状。卷舌着受显性基因T控制。图2 卷 舌1、有卷舌 2、无卷舌2. 眼睑性状调查：人群中的眼睑可以分为单重眼睑（单眼皮）和双重眼睑（双眼皮）两种性状；一般认为双眼皮是受显性基因控制，位显性性状；单眼皮为隐性性状。3.耳垂性状调查：人群中依个体不同，耳朵明显区分为有耳垂和无耳垂，有耳垂为显性

15、性状，受一对等位基因控制，无耳垂的为隐性性状。4.额前发际调查：有些人的额前的发际明显的在前额正中发际向下延伸呈峰形，成V字型（又称美人尖），属于显性；而额前发际基本属于平线的属于隐性。图3前额中央发际有一三角形突出称美人尖1、有美人尖 2、无美人尖5.发式和发旋的调查：人群中发式有直发和卷发之分，其中直发为隐性性状，东方人多是此性状；卷发属于显性性状。人群中的发旋螺纹方向受遗传因素控制，顺时针方向为显性性状，逆时针为隐性性状。6.拇指端关节外展的调查：人群中某些人的拇指的最后一节能够弯向桡侧，与拇指垂直轴线呈60度，该性状为纯合隐性性状。图4 拇指竖起时弯曲情形1、挺直 2、拇指向指背面弯曲

16、7.达尔文结节的调查：人群中有些人的耳轮边缘上有一个（或2个及其以上）小的突起成为达尔文结节，该性状为显性性状。1实验目的（1）了解皮肤纹理的形成与遗传的关系（2）掌握皮纹的印取和皮纹的类型四 、 人类皮纹的观察分析 皮肤纹理(dermatoglyph)简称皮纹。是指人体某些特殊部位，如手指、手掌、脚趾和脚掌等处皮肤上出现的纹理图形。它是由真皮乳头向表皮突起，形成的一条条凸起的乳头线，其上有汗腺开口，称嵴纹(ridge)；各嵴纹间凹下的部分称为沟，这些凸凹的嵴和沟就构成特定的指纹和掌纹。2实验原理 一般认为，人的皮纹终生不变；每个人都有其特定的皮纹，故有种族和个体的差异，因此皮纹长期以来作为侦

17、破案件的手段之一。 大量的研究表明，某些遗传病，特别是一些染色体病、先天性代谢病和先天畸形等常伴有皮肤纹理异常，故皮纹检查可作为某些遗传病诊断的辅助指标。3实验内容(1)器材和试剂器材：放大镜、量角器、直尺、铅笔、红色印油(或黑色油墨)、人造海绵垫、搪瓷盘、八开白纸。试剂：2.5亚铁氰化钾KFe(CN)6水溶液、2三氯化铁(FeCl3)水溶液。将红色印油适量地倒入瓷盘的海绵垫上，涂抹均匀，再将白纸平铺于桌面或玻璃板上，准备取印。受检者洗净双手，擦干后将手掌按在海绵垫上，使掌面获得均匀的印油(注意不要来回涂抹，印油不宜粘得过多)。(2)操作步骤取印时先将掌腕线放在白纸上，然后从后向前依掌、指顺序逐步放下，手指自然分开，适当用力按压手背，尤其是腕部、掌心及手指基部，以免漏印。提起手掌时，先将指头翘起，尔后是掌和掌腕面，这样便可获得满意的全掌皮纹。注意，取印皮纹时不可加压过重，不可移动手掌和白纸，以免使皮纹重叠或模糊不清。滚动式印取指纹。将印好的左、右手掌纹纸移至桌边或玻板边缘，然后在对应的掌纹下方，由左至右依次按印10个手指指尖皮纹。印时，取印的指头伸直，其余四指弯曲，将手指由一侧向另一侧轻轻滚动(切勿来回滚动，以免图像重叠)，以便将指尖两侧皮纹印上，记下10个指尖的顺序。(