核酸提取以及常见问题

1、关于核酸提取及常见问题第一张，PPT共四十二页，创作于2022年6月基因组DNA CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。第二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月CTAB提

2、取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA CTAB法第三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月CTAB提取缓冲液的改进配方 组份

3、Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA CTAB法第四张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 SDS法原理基因组DNASDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖

4、杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2% SDS法DNA提取缓冲液第五张，PPT共四十二页，创作于2022年6月基因组DNA其它方法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法根据细胞裂解方式的不同有：第六张，PPT共四十二页，创作于2022年6月基因组DNA其它方法吸附材料结合法：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值

5、洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。第七张，PPT共四十二页，创作于2022年6月基因组DNA其它方法浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物第八张，PPT共四十二页，创作于2022年6月质粒DNA碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发

6、生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第九张，PPT共四十二页，创作于2022年6月质粒DNA碱裂解法碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液第十张，PPT共四十二页，创作于2022年6月质粒DNA煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价

7、闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第十一张，PPT共四十二页，创作于2022年6月细胞器DNA差速离心法差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。第十

8、二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策第十三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第十四张，PPT共四十二页，创作于2022年6月材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白

9、细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）第十五张，PPT共四十二页，创作于2022年6月细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA

10、的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁第十六张，PPT共四十二页，创作于2022年6月核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取第十七张，PPT共四十二页，创作于2022年6月核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变

11、性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理第十八张，PPT共四十二页，创作于2022年6月多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。核酸分离、纯化第十九张，PPT共四十二页，创作于2022年6月多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与

12、酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合核酸分离、纯化盐离子的去除：70的乙醇洗涤第二十张，PPT共四十二页，创作于2022年6月核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解 基因组DNA的提取质粒DNA的提取第二十一张，PPT共四十二页，

13、创作于2022年6月DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因对策第二十二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的D

14、NA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题问题二：DNA降解。对策 原因第二十三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少。对策 原因第二十四张，PPT共四

15、十二页，创作于2022年6月第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第三部分：RNA提取方法简介第二十五张，PPT共四十二页，创作于2022年6月RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法 原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 RNA提取的通用方法第二十六张，PPT共四十二页，创作于2022

16、年6月异硫氰酸胍/苯酚法 步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。RNA提取的通用方法第二十七张，PPT共四十二页，创作于2022年6月影响RNA提取的因素 材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存如

17、要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，70短期保存影响RNA提取的因素第二十八张，PPT共四十二页，创作于2022年6月影响RNA提取的因素 样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量影响RNA提取的因素第二十九张，PPT共四十二页，创作于2022年6月 纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl

18、沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素第三十张，PPT共四十二页，创作于2022年6月第一部分：DNA提取方法简介第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策内容第三部分：RNA提取方法简介第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策第三十一张，PPT共四十二页，创作于2022年6月RNA提取常见问题 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不

19、佳第三十二张，PPT共四十二页，创作于2022年6月RNA降解 新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。第三十三张，PPT共四十二页，创作于2022年6月RNA降解 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。第三十四张，PPT共四十二页，创作于2022年6月OD260 /OD280

20、比值偏低 蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第三十五张，PPT共四十二页，创作于2022年6月OD260 /OD280 比值偏低 抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线

21、性最好。 用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。 第三十六张，PPT共四十二页，创作于2022年6月电泳带型异常 非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高 。第三十七张，PPT共四十二页，创作于2022年6月下游实验效果不佳 RNA 降解 抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNas