柱前衍生高效液相色谱法分析橘小实蝇蛋白饵剂中的氨基酸

1、基金项目：农业部“948”项目（2009Z40），公益性行业（农业）科研专项（200903047），福建省科技厅重点项目（2010I0002）作者简介：韩英（1985-），女，硕士研究生，主要从事害虫生物防治研究。Email: 通讯作者：陈家骅（1938-），教授，博士生导师，主要从事昆虫分类和害虫生物防治研究。Email:chenjh34柱前衍生高效液相色谱法分析橘小实蝇蛋白饵剂中的氨基酸韩英1，许 晨2，许建中2，陈家骅1*，王波1（1. 福建农林大学益虫研究所，福州 350002； 2.国家海洋局第三海洋研究所，厦门 361005）摘要：采用柱前衍生高效液相色谱法（AccQTag法）测定

2、两种橘小实蝇蛋白饵剂中的氨基酸种类及含量，结果表明两种蛋白饵剂中均含有17种游离氨基酸，18种多肽氨基酸。马来西亚Pupuk Alam公司生产的Prima蛋白饵剂游离氨基酸含量为573.64 mg/100ml，多肽氨基酸含量为5284.76 mg/100ml，多肽含量为4711.12 mg/100ml；本课题组自行研制的橘小实蝇蛋白饵剂游离氨基酸含量为630.10mg/100ml，多肽氨基酸含量为6562.43mg/100ml，多肽含量为5932.33 mg/100ml。关键词：橘小实蝇蛋白饵剂；游离氨基酸；多肽氨基酸1 引言近年来，随着人们环保和可持续发展意识的增强，综合应用蛋白饵剂、昆虫不

3、育技术（SIT，Sterile Insect Technique）和释放寄生蜂逐渐成为国内外防控实蝇类害虫的主要措施1。应用蛋白饵剂防治橘小实蝇，是继化学药剂防治之后发展起来的一种重要的生物防治方法2-5，该法具有使用方便、对环境无污染6、不产生害虫抗药性、不污染果实7、对人和有益昆虫无毒等优点8。美国、印度、澳大利亚等实蝇发生重灾国家早在20世纪50年代已开始用蛋白饵剂防治实蝇害虫3，目前国内市场上的蛋白饵剂有陶氏益农公司生产的GF-120（0.02%猎蝇）和马来西亚的Prima，我国还没有属于自己的蛋白饵剂品牌，本课题组研发了一种新型实蝇蛋白饵剂8，正在部分地区开展试用。氨基酸是调节机体生

4、理活动的重要物质9，实蝇繁殖后代需吸收小分子的蛋白质，它们的口器只能取食0.5-1.0m的微小的小分子短链蛋白质、小肽或氨基酸。由于蛋白饵剂中构成蛋白质的各种氨基酸数量的相对比例也会直接影响到蛋白饵剂的引诱效果，所以传统的以蛋白饵剂中粗蛋白的含量来衡量蛋白饵剂优劣的方法渐渐显示出其不足。所以，氨基酸的组成及含量分析逐渐成为衡量蛋白饵剂引诱效果的一项重要指标。本研究主要通过柱前衍生法对比研究市场化的蛋白饵剂产品Prima和本课题组研发的橘小实蝇蛋白饵剂中氨基酸种类及含量，旨在比较两者氨基酸的差别，为蛋白饵剂的工业化生产质量监控提供方法依据。2 材料与方法2.1试验材料Prima蛋白饵剂：马来西亚

5、Pupuk Alam 公司生产；本课题组自制橘小实蝇蛋白饵剂：啤酒废酵母经浓缩、破壁、酶解等工艺加工后获得。2.2仪器与试剂Waters-e2695高效液相色谱仪， 2998二极管阵列检测器、色谱工作站（美国Waters 公司）、真空烘箱（上海一恒科学仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、离心机、移液器、安瓿管。Waters AccQTag 氨基酸测定方法包（美国 Waters 公司）：包括Waters AccQFluorTM专利氨基酸专用衍生剂、Waters AccQTag氨基酸分析柱（Nova-PakTMC18柱）、玻璃衍生管、浓度为2.5mM（胱氨酸例外，为1.25

6、mM）的18种氨基酸混合标准液、预混合好的流动相A浓缓冲液；乙腈（色谱级）；6M 盐酸溶液。2.3 试验方法2.3.1色谱条件AccQTag 氨基酸分析专用柱：AccQTagTM（3.9150mm），柱温 37；检测波长254nm；流速：1.0ml/min；流动相A：AccQTag氨基酸分析方法包缓冲盐溶液；流动相B：乙腈（色谱级）；流动相C：高纯水。梯度洗脱程序见表1。表1 梯度洗脱程序表Tab. 1 Gradient Table时间流动相A%流动相B%流动相C%曲线0.000.5018.0019.0029.5033.0036.0060.0070.00100.099.095.091.083.

7、00.0100.00.00.00.01.05.09.017.060.00.060.060.00.00.00.00.00.040.00.040.040.0*1166611111162.3.2标准液准备移取氨基酸标准液10l加90l Milli-Q水稀释，按AccQTag制备外标法配成标准液10。2.3.3 样品处理游离氨基酸样品：分别取Prima和自制蛋白饵剂1.0ml置于2.0ml离心试管中，离心10min（13000r/min），用0.45m滤膜过滤，备用。多肽氨基酸样品：取5倍稀释的Prima和自制蛋白饵剂0.5ml，加入1.0ml 6mol/L盐酸-0.5%苯酚溶液于3.0ml安瓿管中，

8、充入氮气11,12，密封，置于110条件下水解24h，取出冷却后离心10min（13000r/min），取10L上清液用Milli-Q水稀释100倍，用0.45m膜过滤，备用。2.3.4 衍生方法三种样品液除了所取样品液体积和加入缓冲溶液体积不同，衍生方法相同，应合并简化标准液的衍生：移取10L 已配制好的含有18 种氨基酸标准溶液加入6 mm50 mm的样品管底部，加入70L硼酸盐缓冲溶液，涡旋混合10 s后，边混合边加入20L衍生试剂溶液到样品管中，密封样品管，室温放置1 min，于55加热10 min，取出冷却至室温，转移至微量自动进样瓶中，进样分析10,13。游离氨基酸样品液的衍生：分

9、别取经过处理的Prima和自制蛋白饵剂样品液10l，放入6 mm50 mm样品管底部，加入70L硼酸盐缓冲溶液，涡旋混合10 s后，边混合边加入20L衍生试剂溶液到样品管中，密封样品管，室温放置1 min，于55加热10 min，取出冷却至室温，转移至微量自动进样瓶中，进样分析10,13。多肽氨基酸样品液的衍生：分别取Prima和自制蛋白饵剂多肽氨基酸样品液取20l，放入6 mm50 mm样品管底部，加入60L硼酸盐缓冲溶液，涡旋混合10 s后，边混合边加入20L衍生试剂溶液到样品管中，密封样品管，室温放置1 min，于55加热10 min，取出冷却至室温，转移至微量自动进样瓶中，进样分析10

10、,13。3 结果与分析3.1 18种氨基酸标准品分析采用2.2.1的色谱条件，通过高效液相色谱仪测得18种氨基酸标准品的色谱图如图1。由图1可以看出，18种氨基酸经衍生后，在2.2.1的色谱条件下得到了很好的分离。几种比较难分离的氨基酸对，His/NH3、Arg/Thr均可获得较好分离效果。图1 18种氨基酸标准品混合溶液的色谱图为什么Asp的峰为红色？是采用手动积分了么？Fig. 1 Chromatogram of 18 amino acid standards3.2 样品中氨基酸的分析通过高效液相色谱仪测得Prima和自制蛋白饵剂中游离氨基酸和多肽氨基酸的种类，结果见图2和图3。结果表明，

11、两种蛋白饵剂中氨基酸经过衍生后在2.2.1的色谱条件下分离效果较好，较难分离的氨基酸对，也可获得较好的分离效果。从谱图中可以看出两种产品均包含17种游离氨基酸、18种多肽氨基酸，胱氨酸为水解后得到的氨基酸，。CBAA. 标准品 B. Prima C. 自制蛋白饵剂图2橘小实蝇蛋白饵剂游离氨基酸色谱图Fig. 2 Chromatogram of free amino acid contentCBAA. 标准品 B. Prima C. 自制蛋白饵剂图3多肽水解氨基酸测定结果色谱图Fig. 3 Chromatogram of polypeptide amino acid content 3.3 样品

12、中氨基酸及多肽的含量通过外标一点法计算得出Prima和自制蛋白饵剂中18种氨基酸的含量，总氨基酸与游离氨基酸的差值则为多肽的含量，结果见表2。结果表明：Prima中总氨基酸含量为5284.76 mg/100ml，游离氨基酸总含量为573.64 mg/100ml，占总氨基酸的10.85%，其多肽含量为4711.12 mg/100ml，占总氨基酸的89.15%。本课题组自制橘小实蝇蛋白饵剂游离氨基酸总含量为630.10mg/100ml，占总氨基酸的9.60%，多肽氨基酸含量为6562.43mg/100ml，多肽含量为5932.33 mg/100ml，占总氨基酸的90.40%。Prima中游离氨基酸

13、 Leu和Phe含量较多，分别为55.68 mg/100ml 和53.81 mg/100ml，His和Met两种含量较少，均未超过15.00 mg/100ml，Cys含量最少为0 mg/100ml；总氨基酸Glu含量最多，达723.18 mg/100ml，增加最多，其他氨基酸均不超过450.00 mg/100ml，但是水解后的样品中存在Cys，含量最少，为12.14 mg/100ml。本课题组自制橘小实蝇蛋白饵剂游离氨基酸 Glu和Ala含量较多，分别为73.46 mg/100ml 和79.12 mg/100ml，His和Met两种含量较少，均未超过15.00 mg/100ml，Cys含量最少

14、为0 mg/100ml。总氨基酸中Glu含量最多，达975.46 mg/100ml，其次是Asp，为616.22 mg/100ml，其他氨基酸均不超过500.00 mg/100ml，水解后的样品中Cys含量最少，为11.82 mg/100ml。以上数据说明两种蛋白饵剂中的氨基酸主要以多肽形式存在，而不是以游离氨基酸形式存在。所有游离氨基酸中Ser、Gly、Pro、Tyr、Val、Met、Lys、Ile几种氨基酸在两种产品中含量相当，而总氨基酸中Gly、NH3、Pro、Tyr、Met、Phe含量相当。表2 蛋白饵剂中游离氨基酸和多肽氨基酸含量对比Tab. 2 Content of free am

15、ino acid and polypeptide amino acid of protein bait 氨基酸名称游离氨基酸mg/100ml总氨基酸mg/100mlPrima橘小实蝇蛋白饵剂Prima橘小实蝇蛋白饵剂AspSerGluGlyHisNH3ArgThrAlaProCysTyrValMetLysIleLeuPhe合计34.5833.4941.4923.0913.0915.2143.2229.8355.7147.93033.6837.8812.8718.8223.2655.6853.81573.6447.2333.0273.4625.0614.8016.0557.2120.7879.1

16、245.06035.3936.7611.1219.5923.8546.4145.69630.10442.05305.42723.18309.73133.36100.88275.23293.58390.00388.8312.14226.94360.0590.52305.12260.00396.35271.385284.76616.22379.02975.46360.24161.25122.18381.98359.73484.77332.8311.82264.69420.55112.57454.07326.91493.15304.996562.434 结论本文采用柱前衍生高效液相色谱法（AccQT

17、ag法）对马来西亚Pupuk Alam 公司生产的Prima蛋白饵剂和本课题组自制的橘小实蝇蛋白饵剂两种产品中氨基酸种类及含量进行了比较，结果表明两种蛋白饵剂中均含有17种游离氨基酸，18种多肽氨基酸。Prima蛋白饵剂中游离氨基酸总含量为573.64 mg/100ml，多肽氨基酸含量为5284.76 mg/100ml，多肽含量为4711.12 mg/100ml，本课题组自制蛋白饵剂中游离氨基酸总含量为630.10mg/100ml，多肽氨基酸含量为6562.43mg/100ml，多肽含量为5932.33 mg/100ml。References1 Zhuang Jianlong(庄剑隆),Fuj

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