茶多酚茶碱离体蛙心灌流设计性实验

1、动物生理学实验设计性实验报告茶多酚和茶碱对离体灌流蛙心活动的实验研究作者：陈子禧学号：1414300004组员：吴咏诗徐国平陈烈双指导老师：陶文琴学院：生命科学学院专业：生物技术班级：2014级生技2班第7小组 陈子禧吴咏诗 徐国平陈烈双 摘要目的实验利用离体青蛙心脏，观察茶多酚、茶碱以及其混合溶液对心肌收缩作用影响，并探 讨其作用机理.结果，茶多酚对心肌收缩力具有双重作用，在1-30ug/ml五个浓度梯度中，随茶多酚浓度 增大，对蛙心肌收缩力的兴奋程度逐渐下降，其中心肌收缩力最大增量为23.78%，心率最大增量为 6.02%；茶碱溶液在0.1-2000ug/ml七个浓度梯度中，茶碱溶液促进心

2、率和收缩力所在的浓度梯度有所不 同；而茶碱与茶多酚混合溶液在低浓度配比下起促进作用，但当茶碱浓度升至5ug/ml时出现心律失常。 离子内流而发挥正性肌力作用。关键词茶多酚；茶碱；心肌收缩力；心率；茶碱（Theophylline是甲基嘌吟类药物。具有强心、利尿、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌和兴奋 中枢神经系统等作用。主要用于治疗支气管哮喘、肺气肿、支气管炎、心脏性呼吸困难，也是复方阿司 匹林的成分之一。茶碱用以治疗哮喘及慢性阻塞性肺疾病（COPD）已达半世纪之久1。茶多酚（teapolyphenol），是茶叶中多酚类物质的总称，也是茶叶中有药理和保健功能的主要成分之一。研究发现茶 多酚具有抗氧

3、化、抗炎、抗肿瘤、抗辐射、抗高血脂、延缓衰老等药理和保健作用，有关茶多酚的研究 目前已成为药学领域的研究热点。本实验利用2种药物在不同浓度下，进行离体蛙心灌流，记录蛙心 收缩曲线，从而反映两种药物对蛙心的作用效应。1材料与方法1.1主要试剂与实验材料茶多酚、茶碱（先配制成不同浓度）；两栖类任氏液；肝素钠溶液；成年青蛙4只（1号成功完成实验，2号在实验中停止收缩，3号分离失败，4号插管后心律不齐） 1.2仪器及设备Medlab记录仪、生物信号采集系统、张力换能器（10g）、蛙类手术器械1套、蛙心插管、蛙心夹、双 凹夹、万能支架、胶头吸管2支、小烧杯20个、分析天平、量筒、移液管。1.3方法1.3

4、.1前期溶液配制（配制方法将以表格形式进行描述）5个浓度茶多酚溶液的配制试剂浓度（ug/ml）配制方法30取茶多酚0.0030g溶解于100ml任氏液中2020ml茶多酚溶液（30ug/ml）+10ml任氏液1020ml茶多酚溶液（30ug/ml）+40ml任氏液33ml茶多酚溶液（30ug/ml）+27ml任氏液12ml茶多酚溶液（30ug/ml）+58ml任氏液7个浓度茶碱溶液的配制试剂浓度（ug/ml）配制方法2x103取茶碱0.1g溶解于50ml任氏液中1x1031ml茶碱溶液（2g/L）+1ml任氏液1x1021ml茶碱溶液（1g/L）+9ml任氏液1x1011ml茶碱溶液（0.1g

5、/L）+9ml任氏液11ml茶碱溶液（0.01g/L）+9ml任氏液1x10-11ml茶碱溶液（0.001g/L）+9ml任氏液5x10-11ml茶碱溶液（1ug/ml）+1ml任氏液3个浓度茶多酚、茶碱混合溶液的配制茶碱浓度（ug/ml）茶多酚浓度（ug/ml）混合后茶碱浓度（ug/ml）混合后茶多酚浓度（ug/ml）5X10-13X1012.5X10-11.5X10113X1015X10-11.5X1011X1013X10151.5X1011.3.2蛙心肌体外收缩的记录 用探针破坏青蛙脑、脊髓（双毁髓）， 开胸暴露并游离心脏。固定蛙心套管，用蛙心夹夹住心尖，进行任氏 液灌流，体外心肌收缩通

6、过张力换能器输入二道生理记录仪，同步记 录心肌收缩活动和心率变化。体外心脏在灌流任氏液稳定一段时间后 灌流含茶多酚、茶碱的灌流液。每次灌药后待心脏收缩幅度稳定时采 样、测量，并迅速用任氏液洗去药液，待心脏收缩力恢复正常时再进 行下一浓度药物灌流。心率变化率和收缩力变化率=给药后的（心率 /收缩幅度）一给药前的（心率/收缩幅度）/给药前的（心率/收缩幅 度）实验结果将分为三组进行记录并以表格形式进行展示2.结果2.1茶多酚对离体蛙心收缩的影响茶多酚溶液从1ug/ml逐渐增加到30ug/ml过程中，对蛙心心肌均有兴奋作用，且在浓度达到20ug/ml时收缩力达到峰值，但这种兴奋作用表现为剂量依赖性，

7、并随继续 增大浓度后对收缩力的兴奋作用下降，可以推断该峰值浓度处于10-30ug/ml之间，但在浓度达到20ug/ml 时已对心率产生抑制作用， 见表1.表1.茶多酚对离体蛙心收缩的影响浓度（ug/ml）心率变化（%）收缩力变化（%）基线变化1+5.41%+4.85%3+4.59%+2.55%10+6.02%+10.71%20-3.24%+23.78%30-5.56%+14.29%2.2茶碱对离体蛙心收缩的影响茶碱溶液从0.1ug/ml逐渐增加到2000ug/ml过程中，对蛙心心肌收缩有兴奋作用，但其中出现有下降情况，且收缩力下降幅度严重，该浓度为1ug/ml，且到达该浓度后 继续上升，收缩力

8、依然增加但增量维持在5%以下；但随浓度不断上升，茶碱始终对心率起促进作用， 并在1X103ug/ml时心率的增量最大，达到15.49%，此时收缩力增量为5%。所以根据数据统计显示， 茶碱灌流液在0.1ug/ml-2000ug/ml之间，均对心脏收缩有一定的兴奋作用。见表2.表2茶碱对离体蛙心收缩的影响浓度（ug/ml）心率变化（%）收缩力变化（）基线变化1X10-1+6.06%+7.06%5X10-1+6.45%+16.67%1+5.56%-30.60%1X101+1.02%+2.32%1X102+10.26%-0.76%1X103+15.49%+5%2X103+6.13%+5.75%2.3茶

9、碱、茶多酚混合溶液对离体蛙心收缩的影响经文献查证34茶叶中两种成分的比例及浓度，我们以茶碱浓度为单一变量，保持每次灌流过程中茶多酚浓度为15ug/ml不变，而将茶碱浓度定为0.25、 0.5和5ug/ml进行灌流，观察混合溶液对蛙心心肌的收缩作用。结果显示当加入最低浓度配比的混合溶 液后收缩曲线立即基线上移，反映出收缩力加强，且收缩幅度加大，收缩力上升45.61%，心率轻微加 快。但后期突然收缩力下降，为防止下降过急，跌至一定程度时，将灌流液中茶碱浓度上升至0.5ug/ml， 此时收缩力重新上升，增量达到41.42%，达到平稳后冲洗后再待平稳进行5ug/ml茶碱灌流，此时加入 茶碱浓度为5ug

10、/ml混合溶液后，收缩力轻微下降，对心率已无明显变化，并出现心律失常状态，在舒 张不完全状态下进行小幅度收缩。可以判断该浓度的混合溶液对蛙心收缩产生有害作用，浓度过高已对 心肌细胞有毒害作用，妨碍其正常收缩功能。见表3.图1.图2图3表3茶多酚、茶碱混合溶液对离体蛙心收缩的影响茶碱浓度（ug/ml）茶多酚浓度（ug/ml）心率变化（%）收缩力变化（）基线变化2.5X10-11.5X101+0.44%+45.61%5X10-11.5X101+3.53%+41.42%51.5X101+0.02%-0.21%图1.30ug/ml茶多酚混合0.5ug/ml茶碱蛙心收缩曲线收缩幅度28.912-5.00

11、89 -2 25 4大卷率蓄平心图2.30ug/ml茶多酚混合1ug/ml茶碱溶液蛙心收缩曲线收缩幅.85 -80 -75 -70 -65 -60 -55 -50 -45 -40 -35 -30 - 30ug/ml茶多酚+lug/ml茶碱IM岫I图3ll30ug/ml.茶多酚混合i0u醐茶碱溶液蛙缩曲线岫岫岫岫峋收缩强858075706560大*率譬平心| 40.352I -3.568 | 2.205 23.61555 -50 -45 -40 -35 -30 -2.4 ?对单独茶升，约象可知度（等力的兴:在1进行行图见l1在:另li倍茶流用强肌.,液I曲时.力可茶碱度g收肌细 的线I.i -.

12、合溶液时$如服据;同收碱）的混该浓 同促进灌胞 I酚配奋作用。另夕卜在加入 30ug/ml茶多酚及 10ug/ml茶碱的等量混合溶液（此时茶碱浓度为5ug/ml:、土流:的和30ug/mi:碱碱茶多m力有茶碱后蛙心出现心律不齐，2每个心动周期伴产生毒害作用，cAMP浓度过高，导致其舛推测wmi的茶碱已过量*对心肌细胞时同（秒）3讨论3.1本实验结果表明茶多酚和茶碱在一定浓度内均对离体蛙心收缩起兴奋作用表现为收缩力增强和心率提升，但在某个茶多酚浓度中仍有心率轻微下降，在某个茶碱浓度中收缩力下降。可能为偶然因 素的影响干扰实验结果，因为成功完成实验个体仅有一个，数据量不足影响实验准确性。通过茶碱和

13、茶 多酚混合溶液灌流的蛙心收缩数据分析可知其对蛙心产生协同作用，使心肌细胞兴奋性提高。3.2茶碱与茶多酚作用机理经有关文献查证，发现其药物作用机理有2点：茶碱对细胞中磷酸二酯酶有抑制作用，通过抑制磷酸二酯酶（PDE）的活性，从而提高细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的含量， 再进一步激活蛋白激酶A（PKA），使多种蛋白磷酸化（包括钙离子通道蛋白），促进心肌细胞收缩。 茶碱作为细胞肌浆网受体的激动剂，能引发对ryanodine敏感的钙池释放，从而促使肌浆网释放钙离子， 增加细胞内钙离子浓度，同时增强肌纤维对钙离子的敏感性（5。所以，在一定浓度内能促进心肌细胞的 收缩。而茶多酚对蛙心肌细胞中的0受体起作

14、用，a受体与钙通道偶联，钙通道开放，钙内流增加，从 而引起心肌发生收缩61另外经查证，茶碱和咖啡因都是甲基嘌吟类药物，结构上仅相差一个甲基，其 作用机理有相似点。3.3茶碱与茶多酚的协同作用推测混合溶液中收缩力明显提升是因为茶碱抑制磷酸二酯酶，从而提高cAMP在细胞内浓度(该点在药物说明书中有提及)，另外引发钙池释放增加钙离子浓度；而茶多酚 激活a受体并与钙离子通道偶联促进钙离子内流。故在两种药物共同作用下增强了心肌的收缩力，并提 升心率。但同样在实验中显示，在茶多酚浓度的影响下，相同的茶碱浓度更易诱发心律不齐，可能由于 茶多酚降低了心律不齐所需的茶碱浓度标准，推测2种药物有可能是竞争性促进心肌收缩。30ug/ml茶 多酚与5ug/ml茶碱混合溶液的实验同样验证了药品说明书上“茶碱制剂可致心律失常和(或)使原有的 心律失常恶化”的特点，但其在合适浓度内，能松弛呼吸道平滑肌，增强膈肌的收缩，从而改善呼吸。 增强膈肌收缩的现象同样在本次离体蛙心灌流实验中出现。参考文献1钟南山，徐军.茶碱类药物在治疗哮喘及慢性阻塞性肺疾病中的作用.中华结核和呼吸杂志J, 1998, 21(1):6-8张晓梦，倪艳，李先荣.茶多酚的药理作用研