组培实验课件(修改稿)

1、学院 组织培养实验室 撰写人签名:课程名称：植物组织培养技术英文名称：Plant Tissue Culture Technology课程总学时 36学时实验总学时20学时开设实验项目数 5 个本大纲属 1.统编 2.自编 3.借用实验教材或指导书;1.统编 2.自编实验者类别: 1.本科 2.专科 3.研究生 4.进修生 5.其它课程类型; 1.独立设课 2.非独立设课实验考试考核方式：操作 实验成绩占课程成绩比例：50%面向专业; 生物科学、生物技术1开出实验项目名称、实验类型及学时1.植物组织培养实验室的基本设备和一般技术（综合性） 4学时2.植物组织培养培养基的制备（综合性） 4学时3.

2、外植体无菌系的建立（综合性） 4学时4.植物材料初代培养与继代培养及培养物的观察与统计 （综合性） 4学时5.试管苗的生根，移栽及苗期管理（综合性） 4学时2实验一.植物组织培养实验室的基本设备和一般技术实验的目的： 了解植物组织培养实验室的设置及基本设备，学习基本仪器设备的使用原理与方法，掌握植物组织培养的基本技术。实验的内容： 一、组培实验室的设置 二、组培实验室基本设备 三、必要的器皿 四、植物组织培养的基本技术 1.洗涤技术 2.灭菌技术3 一、组培实验室的设置1.1 基本实验室包括准备室、接种室和培养室，是组织培养实验所必须具备的基本条件。 1.1.1 准备室 其功能是进行一切与实验

3、有关的准备工作。 主要包括器具的洗涤、干燥和保存；药品的称量、溶解、配制；培养基的分装、包扎和灭菌；植物材料的预处理等。1.1.2 接种室 其功能是进行材料的离体无菌操作。 主要包括植物材料的接种、培养物的转移、试管苗的继代等。1.1.3 培养室 其功能是对离体材料进行控制条件下的培养。 换句话就是人工条件下培养接种物及试管苗的场所.41.2 辅助实验室 辅助实验室是根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室，主要用于细胞学观察和生理生化分析等。1.2.1 细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。 细胞学实验室由制片室和显微观察室组成。 制片是获取显微观察数据的基础，制片室一般配

4、备有切片机、磨刀机、温箱以及样品处理和切片染色的设备等，由于制片过程中所用药品常常是一些具有一定危害的苯、醛类物质，制片室应安装通风橱，并有相应的废液处理设施。 显微观察室放置各种显微镜和图像拍摄、处理设备，便于对实验材料进行认真观察、分析和照相。因而要求房间清洁、明亮、干燥，防止潮湿和灰尘污染。51.2.2 生化分析实验室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。对于一些大型的次生产物生产实验室，还应建立有效物质分离实验室。因此，生化分析实验室的规模和性质需根据整体研究或生产的需要而定。6 1.3 实验室的布局 植物组织培养

5、实验室的布局是非常重要的，布局是否合理不仅影响到是否经济，更重要的是会影响到是否能满足实验要求。实验室布局应在实验室建筑设计时确定，其基本要求是：便于隔离，便于操作，便于灭菌和便于观察。 为了满足这几个要求，实验室的布局可根据组织培养实验的操作程序安排实验室排列。接种室、培养室应放在与外界环境隔离的区域，使之能较长时间保持无菌状态，从而免除频繁消毒的麻烦。灭菌室应与接种室相邻，以便于将灭菌后的培养基及用品直接放置于接种室，尽可能免除再污染。其他实验室的布局可根据条件，以方便实用为宜。71.4 温室 试管苗移栽必须要有温室，如用钢架、玻璃架制造温室成本太高，可用单坡塑料大棚代替，这种大棚在向阳面

6、搭棚，其余三面打墙，以防风保温。成本仅相当与钢架玻璃温室的1/8-1/5.8A 准备室 准备室要求宽敞明亮，以便于放置多个实验台和相关设备，便于多人同时工作。 准备室要求通风条件好，便于气体交换，同时实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。 根据需要和条件，准备室可设计为分体式或通间式。一般用作研究性质的实验室，可设计成分体式，由分开的若干房间将准备室分解为药品储藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等。重点介绍几个内容：9 B. 接种室 接种室也叫无菌操作室，是进行试管苗接种继代的场所，是试管苗生产中最关键的地方，它关系到试管苗的污染率、接种工作效率等。设计技术要求：接种室宜小：密闭光滑，配置拉动

7、门；接种室要求干爽，吊装紫外线灭菌灯，最好安装一小型空调；接种室应设有缓冲间，面积2m2为宜。10C. 培养室培养室大小依规模决定。培养架规格：培养架大多由金属制成，一般设层，最低一层离地高100cm，其它每层间隔30cm左右，培养架即高2m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.2m左右，宽度一般为60cm。培养条件控制：1.温度：一般保持在20-27左右，由空调机调节。2.室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70-80%为好；可安装加湿器。3.光照：安装日光灯和安装定时器，一般需要每天光照10-16h。可白天开灯，也可晚间开灯。 11二、组培实验室基本设备

8、2.1 常规设备1.电子天平 精度高，称量快，但价格较高。 DT200精度0.1g Max 200g用于称取蔗糖和琼脂等 FA1004精度0.1mg Max 100g 用于称取微量元素和植物激素及微量附加物。注意事项：放置天平的地方，要平稳、干燥，避免腐蚀性药品和水气。药品的称量、溶解和保存注意事项： a.药品称取要精确，根据要求使用不同精度的天平称取。 b.称好的药品分别放于小烧杯中，先用少量蒸馏水完全溶解，最后倒入容量瓶，定容到规定的体积；另外,溶解各种药品时要注意混合的顺序,以免发生沉淀,氧化等。 c.容量瓶中的母液应倒入棕色试剂瓶，贴上标签，放入冰箱保存。母液应勤配快用，若放置日久，发

9、现浑浊、絮状沉淀，则失效不能再使用。 12常规设备2. 冰箱各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温保存，某些实验还需对植物材料进行低温处理，在一般情况下均可利用普通冰箱完成。实验一般配备冰箱1-2个。一个用于药品的贮藏，一个用于保存培养基母液以及用作某些植物材料的低温处理。本实验室配置的是：广东科龙 SC-280WLP/H立式冷藏陈列柜3. 酸度计 用于测定培养基以及其它溶液如酶制剂等的pH值，其精度要求因实验需要而定，一般要求可测定pH范围在1-14之间，精度0.01即可。 一般用小型酸度测定仪，即可在配制培养基时使用,也可测定培养过程中pH 值的变化.若不做研究，仅用于生产，也可用p

10、H值为4-7的精密试纸来代替。测定培养基pH值时，应注意搅拌均匀后再测。13常规设备4.离心机 用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取。根据分离物质不同配置不同类型的离心机，如用于细胞、原生质体等活细胞的分离，一般选用低速离心机，而核酸、蛋白质的分离则要选择高速冷冻离心机。以规模化培养生产次生产物的实验室，还应选择大型离心分离设备。5.加热器 用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌器的加热器，规模化大型实验室则应选用大功率加热和电动搅拌系统。有时，亦可用电炉代替加热器，但必须选用适当功率和安全性能好的电炉。对于一些少量培养基的配制也可用微波炉

11、溶化蔗糖和琼脂，但分装前必须充分搅拌均匀。6. 纯水器 离体培养应使用符合要求的的纯水或蒸馏水。用于一般培养，可使用4级过滤的反渗透纯水器，也可使用蒸馏水器。对于一些精确培养试验，有时需要使用双蒸水或超纯水，应配备更高一级的纯水设备。7.分装设备 用于培养基的分装，可以采用手工分装和自动分装。14 2.2 灭菌设备 维持相对的无菌环境是组培实验室的基本要求，因此，与消毒灭菌有关的设备是必不可少的。灭菌设备包括高压蒸汽灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器和紫外灯等。1.高压蒸汽灭菌锅 是常用的主要灭菌设备，一般用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据实验室规模大小可选用手提

12、式、立式、卧式等不同规格的产品。本实验室配置的是：上海申安 LDZX-40BI 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅。2.干热消毒柜 用于一些金属工具如剪刀、镊子、解剖刀等的灭菌，亦可用于玻璃器皿的灭菌，一般可选择温度200 左右的普通或远红外消毒柜。3.过滤灭菌器 用于一些酶制品、激素以及某些维生素等不能高温灭菌试剂的灭菌。根据试剂量的大小可选择不同体积和类型的过滤灭菌器，主要有真空抽滤式和注射器式两大类。4.紫外灯 是方便、经济的控制无菌环境的装置，一般安装在实验室的各个房间，特别是接种室和培养室必须安装，缓冲区一般也应安装紫外灯。15 2.3 无菌操作设备超净工作台最常用、最普及的无菌操作装置工作

13、优点：操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。可长时间使用。工作原理：鼓风机将外界空气从低效过滤器粗滤尘埃，再将空气通过特制的微孔泡沫塑料片层叠组成的高效过滤器过滤消毒，它能除去直径0.3微米的尘埃、细菌和真菌孢子，吹出的气体形成连续不断的无尘无菌的空气层流，以0.35-0.55米秒的流速送到操作台面，用无菌气流将台面带菌气体驱走，使超净台操作室成为无菌空间。超净台使用时间长了过滤器会堵塞，一般低效过滤器每半年清洗一次，高效过滤器视情况34年更新一次。每周开紫外灯2小时杀菌一次超净工作台应放置在空气干净，地面无灰尘的地方种类：水平式和垂直式两种型号，有单人、双人及三人式的，也有开放和密

14、封式的区别.本实验室配置的是：苏州净化设备有限公司 sw-cJ-1cu 双人单面净化工作台162.4 培养设备 培养设备是根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织或器官培养的设施和设备，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。1.培养架：成本低、设计灵活，可充分利用培养室空间，是植物繁殖培养的通用设施。2.光照培养箱及生化培养箱、CO2培养箱 用于植物材料的特定培养。本实验室配置的是:上海精宏实验设备有限公司 GZP-250光照培养箱、SHP-250生化培养箱等。3. 振荡培养箱、摇床 在进行液体培养时，为了改善通气状况，可选择使用振荡培养箱或摇床 。选择此类设备时，应注意根据植

15、物细胞特点选择适宜的振荡频率。4. 生物反应器 利用植物细胞生产次生产物，需根据培养规模选用适宜的生物反应器。172.5 其它设备1.培养室需安装时间程序控制器、温度控制系统等，以控制光照时间和温度.比较小型的实验室，温度控制亦可选择使用空调。2.根据实验需要选择配置相关显微镜，包括实体显微镜、倒置显微镜以及其它显微镜等。为了获取图像资料和数据，一般还需配置与显微镜配套的摄影、录像和图像处理设备。3.根据实际需要，实验室还应配备有用于物质分析的提取、纯化和含量分析设备，如离心机、电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪和酶联免疫吸附测定仪等。18 显微镜显微镜包括双目

16、实体显微镜（解剖镜）、生物显微镜、倒置显微镜，还有相差显微镜、干涉显微镜和电子显微镜。显微镜上要求能安装或带有照相装置，以对所需材料进行摄影记录。（1）双目实体显微镜 双目实体显微镜下可进行培养材料（如茎尖分生组织、胚等）的分离，解剖和观察植物的器官、组织，也可以从培养器皿的外部观察细胞和组织的生长情况。（2）生物显微镜 生物显微镜可用于观察花粉发育时期以及培养过程中细胞核的变化。（3）倒置显微镜 倒置显微镜物镜在镜台下面，可以从培养皿的底部观察培养物。19 三. 必要的器皿3.1 玻璃器皿1.三角瓶规格：有100、250、500ml等，一般使用100ml三角瓶；优点：培养面积大，利于组织生长

17、，受光也比试管好，由于瓶口较小，也不易污染。2.培养皿规格：常用9、12cm直径，要求上下能密切吻合；适于：游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养，看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等。3.试管规格：常用18180mm或20200mm；特点：可用于培养较高的试管苗，不易污染，但培养量较少。4.代用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖；特点：成本较低，操作方便，也减少了培养材料的损伤，但缺点是易引起污染。5.代用塑料器皿特点：具有质轻、透明、不易破碎，成本低等特点，但必须采用聚丙烯材料制成，能耐高温，缺点透明度不好，不能国货灼烧。206.瓶口封塞要求：要具有一定的透气性和密闭性，以防止

18、培养基干燥和杂菌污染。1）以前用棉塞，但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。2）有聚丙烯塑料薄膜，以线绳结扎或橡皮筋箍扎。为了增加透气性，可衬一层硫酸纸。3）也可采用专用的封口膜。7.其他器皿用处：配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿。种类：包括100、250、500、1000ml烧杯；10、100、1000ml量筒；100、1000ml试剂瓶（棕色）等等。21必要的器皿3.2 金属器械组织培养常用的金属器械，可选用医疗器械或微生物实验所用的器械。1).镊子类 包括小型尖头镊子。16cm-25cm长的枪状镊子等。2).剪刀类 常用的有眼科剪、手术剪、弯头剪

19、等。3).分离器械 植物材料的分离、切割和嫁接、需使用解剖刀和芽接刀。前者可用眼科刀和菱形刀代替。刀具也可用双面刀片，旧钢锯条等自制。4).过滤器械 有些不耐高温的物质，如玉米素等，以及某些维生素类，可使用5号、6号过滤器来除菌，但这种漏斗洗涤麻烦。可用金属漏斗，内垫灭过菌的微滤孔膜，使用方便。5).接种针 用来转移细胞和愈伤组织。22四、植物组织培养的基本技术4.1 洗涤技术 培养器皿和用具的洗涤时保证培养物正常生长的重要环节。使用不洁的培养器皿和用具可能影响培养基的组成成分，甚至导致实验的失败。培养器皿和用具的洗涤应选择适当的洗涤剂，采用科学的洗涤方法。 最常用的洗涤剂分为两类，一是合成洗

20、涤剂，二是铬酸-硫酸洗涤剂。 洗涤方法：新的玻璃器皿洗涤方法是：用1%HCl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1-2次，干燥后即可使用。吸管、滴管等玻璃制品，先放入铬酸洗涤液浸泡2小时以上，取出后用流水冲洗0.5小时左右，再用蒸馏水冲洗1-2次。塑料用品洗涤一般选用合成洗涤剂。金属用品一般不宜用各种洗涤剂洗涤，一般用酒精擦洗，并保持干燥。23 4.2 灭菌技术灭菌是指杀灭培养物、培养基、培养用具及培养环境的杂菌，是防止微生物污染的最重要、最基本的环节，是植物组织培养技术中首先必须注意的问题。所用的培养基、培养器皿、各种操作工具及培养材料都要进行灭菌。灭菌一

21、般有物理方法和化学方法两种：物理方法是利用高温、射线等杀死微生物或通过过滤、离心沉淀等去除微生物。化学方法主要是使用消毒剂、抗菌素杀灭微生物。在实际工作中，需根据不同的材料和要求选用相应的灭菌处理方法。具体说明如下：1.培养基灭菌：一般采用高温高压灭菌或过滤灭菌。2.玻璃器皿灭菌：可选用湿热和干热灭菌方法灭菌。3.金属器具灭菌：使用前干热灭菌，使用过程中70%酒精浸泡，酒精灯火焰灼烧，冷却后使用。4.操作环境灭菌: 气体熏蒸或紫外线照射。24 实验二.植物组织培养培养基的制备实验的目的： 掌握MS培养基的配制方法。实验的内容： 一、母液的配制 二、培养基的制备 1.培养基制备程序 2.培养基的

22、高压灭菌25 1.母液的配制配制母液有两个好处：可减少每次配制称量药品的麻烦；减少极微量药品称量时造成的误差。以MS培养基为例，一般需要准备四种母液： a.大量元素母液：可配成10倍母液，用时按比例吸取。配制母液时应注意：分别称量；充分溶解；注意混合秩序：Ca2+应最后加入，与SO42-和HPO42-错开，以免产生沉淀；混合时要缓慢，边搅拌边混合。 b.微量元素母液：因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，用时按比例吸取。注意的原则同大量元素。 c. Fe盐母液：必须单独配制，一般扩大200倍，用时按比例吸取。在配制时，EDTA钠盐需用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75-80之间使其螯

23、合1小时。使用螯合铁的目的：避免沉淀；缓慢不断地供应铁。 26 母液的配制d. 有机化合物母液：主要是维生素和氨基酸类物质，一般配成50-100倍的母 液，用时按比例吸取。e. 激素：每种激素必须单独配成母液，其浓度为0.1、0.5或1mg/ml，多数激素 难溶于水，配法如下： IAA、 IBA、 GA3先溶于少量酒精，再加水定容； NAA 可溶于热水或少量酒精中，再加水定容； 2,4-D 不溶于水，可用1mol/L的 NaOH溶解后再定容； KT 和 6-BA 先溶于1 mol/LHCl中，再加水定容; 玉米素ZT先溶于少量95%酒精中，再加水定容. 27 MS培养基大量元素母液用量表序号

24、成 分 规定量(mg/L)扩大倍数称取量 (mg)母液体积 每升培养基 (ml) 吸取量(ml) 1KNO3 1900 10 19000 1000 100 2NH4NO3 1650 10 16500 3MgSO47H2O 370 10 3700 4KH2PO4 170 10 1700 5CaCl22H2O 440 10 440028MS培养基微量元素母液用量表序号 成分 规定量 (mg/L)扩大倍数称取量 (mg)母液体积 (ml)每升培养基 吸取量(ml) 1MnSO44H2O22.3 1002230 1000 10 2ZnSO4 7H2O8.6860 3H3BO36.2620 4KI0.8

25、383 5Na2MoO42H2O0.2525 6CuSO45H2O0.0252.5 7CoCl26H2O0.0252.529 MS培养基铁盐母液用量表 序号 成分 规定量 (mg/L)扩大倍数称取量 (mg)母液体积 (ml)每升培养基 吸取量(ml) 1Na2 EDTA 37.3 100 3730 1000 10 2FeSO4 7H2O 27.8 278030MS培养基有机物母液用量表序号 成分 规定量 (mg/L)扩大倍数称取量 (mg)母液体积 (ml)每升培养基 吸取量(ml) 1甘氨酸2.0 50100 500 10 2盐酸硫胺素VB10.1 5 3盐酸吡哆醇VB60.5 25 4烟

26、酸0.5 25 5肌醇1005000312、培养基的制备程序培养基配制程序如下： (水、药、糖、琼脂) 混合 pH调整 加热溶解 分装 玻璃器皿 水洗 干燥 加棉塞 高压蒸汽灭菌 冷却 凝固 接种32培养基的配制及高压灭菌1.称出规定数量的琼脂和蔗糖,加水直到培养基最终容积的3/4，在电炉上加热溶解，在配制液体培养基时无需加热，因为蔗糖在微温的水中也可以溶解。2. 分别按配方逐个加入各种母液，包括生长调节物质和其他的特殊添加物。3. 加蒸馏水直至培养基的最终体积。4. 充分混合之后，用0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl调节培养基的pH。一般来说，植物组织培养适合的pH值为5.8，

27、当pH高于6.0时，培养基将会变硬，低于5.0时，琼脂就不能很好的凝固。5. 把培养基分装到所选用的培养容器中，每个25150mm的试管约装15ml；每个150ml三角瓶约装50ml。6. 用合适的材料封住瓶口。7. 把装入培养基并封口的培养容器放入高压锅，开始高压灭菌，121，保持15-20min8. 灭菌结束后，切断电源，待压力指针回零后，取出培养基，在室温下冷却后，置于温度低且无强光照射的防尘橱暂时保存待用。33实验重点：1、pH值的调整 培养基的pH值(培养基的酸碱度)，直接影响到培养物对离子的吸收，所以过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响，此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。

28、当培养基配制好以后，应随即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无此设备也可用精密pH试纸(应在干燥器中保存)，培养基p值调整可用0.mol HCl或0.1mol NaOH。经高压蒸汽灭菌后，由于某些成分的分解，如蔗糖的分解或氧化，酸度会增加，即pH值可降低0.2。2、分装： 培养基合成后要趁热分装，100ml的容器约装入30-40ml培养基，即1L培养基约装35瓶左右。太多则浪费培养基，太少不易接种和影响生长。但要根据培养对象来决定。如果培养时间较长时，应适当多装培养基，生根等短期培养时，可适当少加培养基。分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。34 实验重点：3、加塞(封口)

29、： 培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证优良的通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形与未开伞的蘑菇相似，其大小、松紧都应适当。加塞时，棉塞总长度的3/5应在口内，2/5应在口外。作棉塞的棉花要选用纤维较长的，一般不用脱脂棉作棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格也较贵。在微生物实验或科研工作中，常常要用到通气塞。所谓的通气塞就是用几层纱布（一般是六至八层）做成的、通气性能更加良好的塞子。通气塞加在装有液体培养基的三角烧瓶瓶口

30、上，放在摇床上进行振荡培养，可获得更多的氧气来促进菌体生长或进行发酵。注意: 棉塞塞好以后，试管用棉绳扎成捆。在棉塞的外面包上一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水的沾湿和灭菌后的灰尘侵入。然后再用棉绳扎好，挂上标签，注明培养基的名称及配制日期。写上培养基种类，准备灭菌。注意不能放置时间过长，以免产生污染。35 实验重点：4、培养基的配制及高压灭菌 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下,锅内温度达121。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意

31、：完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1-0.15MPa，20min。36实验重点：5、高压蒸汽灭菌锅的使用方法a. 加水：直接往灭菌锅内加水至高水位 ；b. 装料：将待灭菌的物品放在灭菌桶内。包于包之间留有适当的空隙，以利蒸汽的流通。c. 密封： 上下对齐，拧紧螺栓，切勿滴漏气。d. 升压： 接通电源加热 ，排尽锅

32、内空气；压力、温度都上升，e. 灭菌： 待压力表上升达到0.1MPa时，锅内温度达121，开始计时，20min。f. 降压： 达到规定的灭菌时间后， 切断电源，让其自然降压冷却。g. 取料：待压力完全降至“零”后，打开放气阀，再松动螺栓，拿掉盖子，从灭菌筒内取出灭过菌的材料。h. 倒水：灭菌锅用好以后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久腐蚀。37 讨论：如何选择合适的培养基选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑：一是基本培养基；二是各种激素的浓度及相对比例。在选择一种新的植物材料进行组织培养时，为了能尽快建立起再生体系，最好选择一种基本培养基。当通过一系列初试之后，可再根据实际情况对其中的某些成分做

33、小范围调整。在进行调整时，以下情况可供参考：一是当用一种化合物作为氮源时，硝酸盐的作用比铵盐好，但单独使用硝酸盐会使培养基的pH向碱性方向漂移，若同时加入硝酸盐和少量铵盐，会使这种漂移得到克服；二是当某些元素供应不足时，培养的植物会表现出一些症状，可根据症状加以调整.培养基外源激素的作用也会使培养物出现上述一些类似的情况，所以应仔细分析，不可轻易下结论。38 实验三.外植体无菌系的建立实验的目的： 学习外植体无菌系的建立过程及操作。实验的内容： 一、外植体材料的选取，以葡萄等嫩茎段做材料 二、外植体消毒器皿、消毒剂的准备 三、外植体材料的消毒 四、外植体材料的接种39一、外植体材料的选取 外植

34、体是指植物组织培养中的各种接种材料。包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体等。 在操作时，最好将取材植株放在室内或较为清洁的环境中生长一段时间，不要使植株遭受雨淋，应避免用喷水的方法给植株供水。否则当水分蒸发后，所遗留的钙斑有时会将细菌等微生物覆盖，在给外植体消毒时，这些细菌由于包埋在钙斑中难以被杀死。随着培养的进行，这些细菌有时会从破碎的钙斑时进入培养基，从而给以后的培养埋下隐患。 无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。40外植体材

35、料的选取方法1.选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。2.选择最适的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。一般进行快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，如选取茎尖，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高，携带细菌数量较少，在器官建成上也更为容易，因此是花卉组织培养中经常采用的部位。此外，嫩叶、花蕾等携菌量较少，容易形成愈伤组织。相比之下，生长时间较长的块茎、鳞茎、球茎等，往往由于携菌量

36、较多，不易消毒而难以培养成功。花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。3.选取适宜的大小建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.51.00cm之间。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。41 以葡萄的嫩茎为例：葡萄茎属于茎段培养，茎段培养指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。培养茎段主要的目的是快繁。其次也可探讨茎细胞的生理特点，以及进行育种上的筛选突变体的过程。 茎段培养用于快速繁殖的优点在于：培养技术简单易行，繁殖速度较快；

37、芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖问题等。 具体方法如下：取生长健壮无病虫的幼嫩茎，剪去叶片，剪成3-4cm的小段。在自来水中冲洗1-3小时，在无菌条件下用75%酒精灭菌30-60秒，再用饱和漂白粉液浸泡10-20分钟，因材料老嫩和蜡质多少而定时间。最后用无菌水冲洗数次，以备接种。取材时注意茎的基部比顶部切段，侧芽比顶芽的成活率低，所以应优先利用顶部的外植体，但由于每个新梢仅一个顶芽，也可利用腋芽，茎上部的腋芽培养效果较好。还应注意尽量在生长期取芽，在休眠期取外植体，成活率降低。如苹果3-6月取材的成活率为60%，7-11月下降到10%，1

38、2-2月都下降到10%以下。举例说明：42二、外植体消毒器皿、消毒剂的准备 外植体在接种之前，须经严格地灭菌。由于灭菌剂的种类不同，杀菌力不同，因此选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间。现将常用的消毒剂列于下表中:43 常用消毒剂44三、外植体材料的消毒 污染的发生与培养植物的基因型、外植体来源、分离季节、组织大小及操作人员的技术水平等有关。取材组织越大越易污染，夏季取材比冬季取材带菌多，不同年份的污染情况也有所差异。组织培养中要获得无菌材料，在综合上述情

39、况的基础上，还要选择适宜的消毒剂。由于不同植物及同一植物不同部位，有其不同的特点，它们对不同种类及其浓度的消毒剂敏感反应也不同，所以开始要预备实验，以达到最佳的消毒效果。外植体消毒的步骤如下图所示：45外植体消毒步骤46外植体消毒的具体操作方法 一般情况下:a.如果外植体较大而且硬，可直接用消毒剂处理，如果实、叶片、茎段、种子等的消毒；b.如果是幼嫩的茎尖，一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解剖显微镜取出需要的茎尖大小培养；c.如果是未成熟胚、胚珠、胚乳、花药等，一般先把子房或胚珠、花蕾表面消毒，再在无菌条件下剥出需要的外植体；d.如果是细胞，应按培养目的，选择合适的起始材料进

40、行相应的外植体消毒。47 葡萄组织培养中对外植体的消毒方法很多。甘肃农业大学研究成功的综合无伤消毒法，损失小，成功率高。其技术关键在于：休眠枝插入干净沙床，洁净室萌发。若田间取材，要在晴天取上部嫩梢，室内或田间均按无菌操作进行。无菌操作尖取嫩梢，除去大叶片，剪成短于广口瓶的枝条，放在无菌的广口瓶内，倒入无菌睡浸泡和冲洗。倒去无菌水，加入0.1%升汞，剧烈摇晃5min-8min，无菌水冲洗3次，剪去受伤叶面，剪成但芽茎段，接入培养基中，一瓶接一个，登记标号。 葡萄外植体的消毒方法48四、外植体材料的接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全

41、部操作过程。整个接种过程均需无菌操作。 外植体接种过程如下图所示：49 外植体接种过程 501.外植体和接种工具等消毒灭菌要彻底。2.要时刻树立无菌观念：接种过程中不能做挠头、接听手机等与接种无关的事情；已经灭菌过的接种工具、滤纸、接种材料等不要接触未经灭菌的地方等。3.瓶口在打开后和扎口前均要火焰灼烧灭菌，接种室始终在酒精灯火焰无菌区内。4.动作要准确、迅速、无误。外植体接种注意事项51实验四. 植物材料初代培养与继代培养及培养物的观察与统计实验的目的： 1. 学习和了解植物组培过程中初代培养及继代培养植物生长分化情况和形态建成过程， 2. 掌握培养物的观察和统计方法。实验的内容： 1、实验

42、方案的设计 2、初代培养物的建立 3、试管苗的继代培养 4、培养反应的观察与统计52一、实验方案的设计1.单因子实验设计 单因子实验是组织培养中最常用的实验方法，尤其在选择适当的激素种类和浓度配比上使用最多。 所谓单因子实验就是在实验中保持其他因素不变，只改动其中一种因素，从而找出这一因素对实验材料的影响及影响程度。基本培养基种类，糖浓度，培养基的pH值，光照强度及时间，培养温度等可以作为众多因素中的单因子受到测试，找出最适宜值。为了排除偶然因素的干扰，各种处理必须设置一定量的重复，一提高准确度。一般各种重复至少3次以上，每瓶3块以上培养物，设置的重复数量越大，所取得的的结果越可靠，如果实验材

43、料有限，也可灵活掌握。2.正交实验设计 植物离体培养的成功是由多种因素决定的。正交设计是多因素分析的有力工具，它可以很方便的从众多因素中选出主要影响因素及最佳水平，因为它可以用很少的实验次数得到较多的信息，例如，一个7因素水平的实验，若将每个因素水平全部组合都做一遍，需要27 =128次，而正交设计只需做8次实验就可以了，虽然实验次数减少了，但因为各因素水平搭配均匀，8次实验基本代表了全部实验的情况。53二、初代培养物的建立植物组织培养的成功，关键在于初代培养，亦即能否建立起无菌外植体。 在生产实践中有些种似乎很容易解决，而有的种反复多次也难以成功。这在于是否真正了解初代培养的特点，并在操作的

44、每个环节予以认真对待。1、保证无菌 在一个周围严重污染的环境中，要千方百计保证培养材料和培养基的无菌状态及培养室的良好清洁环境条件，这是组织培养成功的基本前提。2、条件适合 要成功地建立初代培养，首先，一定要选择好合适的作物种类、品种以及培养的部位；其次，一定要选择合适的培养基，激素以及其他添加物；还要注意掌握适宜的环境条件。3、操作技术过关 要建立初代培养，操作技术也是十分重要的，特别是熟练的操作技术。54初代培养物的发育1.顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转

45、接继代，重复芽-苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用

46、切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。552.不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与胚状体不同)。多数情况下它先形成芽，后形成根。 另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。在许多常规方法中不能无性繁殖

47、的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。 在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。563.体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞产生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。57初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使

48、整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。 58褐变的主要原因如下：植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。 生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外

49、植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。 59防止、减轻褐变现象的措施选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。使

50、用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用0.1-0.5的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。连续转移 对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-lOd后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。60三、试管苗的继代培养1.在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。2.继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程

51、。3.继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。 切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MSo基本培养基； 分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS。培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养4.增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖5.在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使

52、其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。61继代培养时材料的玻璃化1.实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。2.呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。其嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的。3.在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。62防止玻

53、璃化的方法增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；减少培养基中含氮化合物的用量；增加光照；增加容器通风，最好进行C02施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。63四、培养产物的观察与统计 材料接种培养后，要经常进行培养后的观察，及必要的调查统计，根据生长情况决定下一个步骤，是转到新的培养基，还是在培养基上继续培养，或是培养成功或失败，或是可移栽等。观察与统计的主要内容包括以下4个方面：1.愈伤组织 在离体培养条件下，培养的植物细胞、组织或器官材料，由于切伤后分泌的伤源激素和

54、培养基中添加的外源激素共同作用下，往往会发生愈伤组织。以培养材料总数为分母，诱导产生愈伤组织材料数为分子，可算出培养材料的诱导率。2.胚状体 在非洲紫罗兰叶片的培养中，胚状体是很容易从形态发生数量等方面加以观察区分出来的。以培养材料总数与分化产生胚状体材料的数目，可以算出胚状体的发生率。64观察与统计的主要内容3.芽 芽的产生有两种情况，一种是从愈伤组织上产生不定芽，再一种是从茎尖、侧枝等产生，由于培养基中天家高细胞分裂素的作用，促进腋芽的萌发，培养中很容易用肉眼观察到，经一个周期的培养可长成一丛芽。产生的芽还可分离接种继续扩大繁殖，或分离至生根培养基培养，得到完整植株，以培养的材料总数与分化产生芽的数目，可计算出分化率与每个材料产生芽数。4.根 根的培养发生大多所需时间较短，仅个别木本植物长些，一般较容易观察。根的起源有两种，一种起源与苗基切口处形成的愈伤组织上，有愈伤组织内部形成，另一种起源于苗基切口处愈伤组织的上部，直接起源于中柱鞘细胞，由于其发生与茎的中柱相连，故利于移栽成活。最后可计算出发根率（发根芽数/培养芽数）与每个材料平均发根数。65实验五、试管苗的生根、移栽及苗期管理实验的目的： 了解试管苗的生根过程与移栽过程，掌握其原理，方法，学习试管苗移栽后的管理方法及注意事项，深刻理解“试管苗生根移栽