琼脂糖凝胶电泳

1、一、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入 到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。 由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正 极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不 同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使 其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量 相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量 标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以 提供一

2、个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量漠化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254365nm 波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb50kb范围内的DNA片段。本实验介绍 琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。二、仪器及试剂仪器及耗材：水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点 样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。试剂及配制：50XTAE 缓冲液的配制：2 mol/L

3、 Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA (pH 8.0) 配制1000 ml Tris 242 g 冰乙酸57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温 保存。1XTAE缓冲液的配制：称量20 ml的50XTAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。漠化乙啶贮存液：10 mg/ml漠化乙啶配制：100 ml称取1 g漠化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将 溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。6X上样缓冲液：0.25%漠酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30

4、%甘油。配制：10 ml漠酚蓝25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6XTAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20C保存。其它试剂：DNA样品、DNA Ladder、琼脂糖、三、操作步骤制备1%琼脂糖凝胶（大胶用70ml，小胶用50ml）:称取0.7 g（0.5 g）琼脂 糖置于锥形瓶中，加入70 ml （50ml） 1XTAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮 沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶 玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平 位置，并在固定位

5、置放好梳子。将冷却到65C左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地 倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温 下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽 中。添加1XTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最 终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽 内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围 的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极（黑 色）向正极

6、（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当 漠酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的漠化乙锭1 XTAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。四、常见问题及注意事项配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。电泳时应注意电源线路，预防触电。漠化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专 门的实验室内使用。紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。DNA带形状模糊：DNA加

7、样过多；电压太高；凝胶中有气泡。质粒DNA的存在形式有3种，共价闭环DNA （cccDNA），常以超螺旋形式存 在；开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂， 因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；线状DNA，因质粒DNA 的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带， 它们的泳动速度为：cccDNA 线状DNA ocDNA。1.琼脂糖凝胶电泳的准备和操作方法1.1制备琼脂糖凝胶是应注意避免气泡用缓冲液配制所需浓度的琼脂糖凝胶，水浴或微波炉中加热使琼脂糖完全 融化，将溶液冷至55 C，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板或有机玻璃板

8、封边，放 置样品梳（梳齿下端离玻璃板0.5 -1.0mm ）。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不 间断地倒在玻璃板上或有机玻璃板模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气 泡混入），室温下自然凝固。待完全凝固后小心取出加样器，在电泳槽中加入 适量电泳缓冲液，使胶板浸没在电泳缓冲液下约1mm处。1.2样品制备与加样所加样品应有适当浓度与较小体积，用微量注射器缓慢加入样品，点样时电 源必须处于关闭状态。为了指示电泳的距离，避免样品在电泳槽缓冲液中飘浮， 常在制备好的样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂（漠酚蓝、二甲苯青等）的 上样缓冲液。另外，样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区带消失、前沿 不齐等现象

9、。样品中DNA含量以每条区带的DNA不少于0.1 u g为宜，DNA浓 度过高会使电泳区带变宽，泳动距离异常。样品的用量由加样孔的体积决定，通常为10-50 u g。1.3电泳电泳温度视需要而定。对于大分子的分离，宜低温，电压应低（一般不超过 5V/cm ）。普通电泳可在室温进行，电泳的电压为5-15V/cm。1.4染色一以DNA电泳为例常用荧光染料漠化乙锭（EB ）进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带。EB能插入DNA分子中碱基对之间，使EB与DNA结合（超螺旋DNA与EB结合 能力小于双链闭环，而双链闭环的DNA与EB结合能力小于线状双链DNA ）。将 以染色的凝胶浸泡在1mmol/l

10、MgSO 4溶液中1小时，可以降低未结合的EB所 引起的背景荧光，以提高检测的灵敏度。EB染料有很多优点：操作简便多余的EB不干扰紫外线灯下的检测（因为只有结合了核酸的EB才能显示荧光） 不会使核酸断裂（其他染料不易做到这一点）灵敏度高，且对DNA或RNA均可显色EB可以加到样品中，并可随时用紫外线吸收追踪检查，染色之后还可用正丁醇 提取除去EB但必须注意，EB染料具有潜在的致癌性，应避免直接接触，使用时必须带手套。1.5样品回收常用有下列方法电泳结束后在紫外线下观察样品的分离情况，对需要的DNA 分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同方法进行回收。(1)电泳完毕后，于紫外线下切下需回收的DN

11、A区带，将凝胶条置于含有适量 缓冲液的透析袋中，再放入电泳槽电泳30-60分钟，使DNA分子泳动 透析袋电洗脱法一本法适用于分子量较小的DNA片段的回收。到透析袋靠正极一侧的壁上，然后反向电泳30-60秒，使贴在透析模上的DNA分 子泳动到袋PH为8.0的缓冲液中。吸出袋内的缓冲液并用正丁醇抽提或乙醇沉 淀所需的DNA分子。(2)采用低融点琼脂糖制备的电泳凝胶，电泳完毕后可在紫外灯下切下拟回收的 DNA区带，于65 C保温10-20分钟。胶条融化后，再用酚-氯仿抽提，最后 用95%的冷乙醇沉淀抽提DNA片段，此法回收率可达80%。优点是可直接在融 化的凝胶中进行各种酶反应。但操作时应严格控制融

12、胶和电泳温度。 低融点琼脂糖法(3)用琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分离后，于紫外灯下在紧靠待回收DNA片段 前方切一裂隙，将条状DEAE纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至带中所有的DNA 均转移至膜上。再用低粒子强度的缓冲液洗掉膜中杂质，然后在高离子强度的缓 冲液中将DNA洗脱下来，最后用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀DNA分子。本法回收 的DNA纯度很高。DEAE纤维素膜法一本法适宜小于5kb的双链DNA分子的回收此外，还有醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等。目前琼脂糖凝胶电泳样品回收存在的问题主要有以下几方面：绝大多数的琼脂糖混杂有硫酸盐多糖，它能与DNA 一起从凝胶中被抽提 出来，这些物质是许多酶的强抑

13、制物；可将回收的DNA沉淀数次或采用超纯琼 脂糖的方法解决这一问题。从琼脂糖凝胶抽提出DNA的效率与其分子量有关。琼脂糖凝胶电泳可以十 分有效地回收小于1kb长度的DNA片段。随着DNA分子量增大，回收量则显著 降低，片段大于20kb时，回收率很难超过20%。三、在医学中的应用琼脂糖 凝胶电泳是分离、鉴定、纯化DNA片段的主要方法，目前主要用于重组基因的 分离、鉴定、限制性酶切图谱分析、Southern、Northern、Western杂交分析， 以及PCR产物的分离鉴定等。测定CK和CK-MB是目前用于证实心肌损伤和心 肌梗死早期诊断的指标之一。使用免疫抑制法测定CK-MB易受CK-BB和异

14、常CK 的干扰，导致CK-MB测定假性升高。采用琼脂糖凝胶电泳可分离出三种CK同功酶，分别为 CK-MM、CK-MB、CK-BB。当出现异常同功酶如巨分子CK时，在电泳图谱上很 易被发现，从而避免误诊。血清经琼脂糖凝胶电泳后，用胆固醇基质试剂均匀铺 在凝胶表面，孵育一段时间，即可见清晰的蓝色条带，依次是高密度脂蛋白胆固 醇、快前B脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。凝胶 片用冰醋酸固定、水洗、烤干后，570nm波长扫描，即可确定各组分的百分率 含量。根据血清总胆固醇值可求得这四种脂蛋白胆固醇值。琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D半乳糖3，6-脱水-L半乳糖。

15、许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼 脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的 抵抗力。在PH4.0 - 9.0的缓冲液中是稳定的。由于其分子上无带电基团，在 缓冲液离子强度大于0.05时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨 率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中， 如DNA分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。 当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA （球形）不能进入胶中，相对迁 移率为零，而同等大小的直线DNA （刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁 移率大于零。脂蛋白可在

16、不同的支持介质中进行电泳分离，但最常用的是琼脂糖 电泳。电泳后用脂溶性染料使脂质部分着色，用光密度计扫描得出各部分脂蛋白 的相对比例。异常脂蛋白血症分型时应参考血脂及载脂蛋白测定结果。源自百度百科原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理 与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛和“电泳的双重 作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质 在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于 净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。 但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广 泛应用于

17、核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据PH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同， 因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的PH在69之间，离子强度0.020.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂 糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低， 但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb， 利用脉冲电泳，可分离高达10”7bp的DNA片段。操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺 失的现象。1、选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨

18、率高的 电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通 电泳可能跑不出胶孔导致缺带。2、正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在 0.52%之间，低浓度的用来进行 大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心 操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小 相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。3、适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳 时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后， 离子强度

19、降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊 和不规则的DNA带迁移的现象。4、电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30C，对于巨大的 DNA电泳，温度应该低于15C。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导 致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致 小片段跑出胶而出现缺带现象5、DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和 状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失 的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要