流式细胞术的工作原理及其在免疫学上的应用

1、流式细胞术(FCM )的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry, FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定 量分析的新技术。它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术， 具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。随 着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非 常重要的作用。本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学 等方面的应用进行了综述，展示了 FCM在免疫学上应用的广阔前景。关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的

2、一种快速对单细胞或微粒定量分析 和分选的新技术。其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的， 可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行 多参数分析。流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆 技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学 科尤其是在免疫学方面得到广泛应用1。近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技 术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大 进展。流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免 疫学独特的科学分支，成

3、为研究细胞免疫学的先进技术之一。随着科学技术的发 展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是 各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM研究各 种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径。.流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞 或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中 以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光 /或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个 固态装置），光检测器把散射光

4、定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后 而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感 兴趣的细胞进行分选。流式细胞技术是一种能够对细胞或微球的物理、生理、生化、免疫、遗传、 分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测并集电子技术、计算机技术、 激光技术、流体理论于一体的现代分析技术。1.2流式细胞仪的结构：流式细胞仪的组成:由细胞流动室、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统4 部分组成。流式细胞仪的特点：快速，最高每秒可测数十万个细胞；进行多参数 相关测量囹；可根据测量信息对细胞进行分选。流式细胞仪一般分为科研型和临床型两种。科研型流式细胞仪功能齐全，分 析灵活，

5、但操作比较繁琐，必须由经过正规培训的专业技术人员进行操作；临床 型流式细胞仪易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验中应用。对某 种特征的细胞，还可利用科研型流式细胞仪的分选功能将其分选出来，进行培养 或其他处理，做更深人的研究。1.3流式细胞仪的工作原理：流式细胞仪的工作原理是将待测标本制成单细胞悬液，经染色后进入流动 室，流动室充满流动的鞘液，鞘液压力与样品压力是不同的，当两者的压力差异 达到一定程度时，鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。若 将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料，那么这些染料将在细胞通过激光 检测区时受激光产生特定波长的荧光，通过一系列信号转换、

6、放大、数字化处理， 就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。选择不同 的单克隆抗体及荧光染料，可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同 的特征，如果对具有某种特征的细胞有兴趣，还可以利用流式的分选功能将其分 选出来，以便进一步培养、研究。.流式细胞术的在免疫学中的应用FCM以它的快速、灵活及定量分析的特点被广泛地应用于免疫学的基础研 究和临床应用的各个方面，尤其是在研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受 体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾 病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等起着重要作 用，并且成为现代免疫技

7、术的重要组成部分。2.1对淋巴细胞亚群进行分析血液中淋巴细胞免疫表型（亚群）分析是FCM最主要的功能之一。由于FCM 的高灵敏度、高速度和多参数分析，对血液中淋巴细胞免疫表型检测比其他方法 更精确。故FCM被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法6。通过 FCM分析淋巴细胞免疫表型，不仅对于了解淋巴细胞的分化、功能、鉴别新的 淋巴细胞亚群有重要价值，而且通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群或某 些细胞表面标志的存在、缺乏、过度表达等，对免疫性疾病、感染、肿瘤等疾病 的诊断、治疗、免疫功能重建等都有重要的临床意义。利用抗原抗体特异性反应原理，将不同单克隆抗体设法带上各种荧光染料作 为荧光标

8、记（荧光探针），这种荧光探针与单克隆抗体能牢牢结合。当细胞被激 光器发射的激光照射后，细胞膜的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同 光谱的继发荧光，带荧光探针的单克隆抗体与细胞表面相应抗原的结合的继发荧 光量转换成电信号，这就代表了细胞表面的抗原量。这些荧光通过流式细胞仪的 识别和分辨，从而实现对细胞表面抗原的定量检测。细胞免疫反应一般分两种： 直接免疫反应，即细胞表面抗原与带荧光探针的单克隆抗体特异结合的免疫反 应；间接免疫反应，细胞表面的抗原与单克隆抗体结合，带荧光的第二抗体又 与抗体结合，也使这个抗原-抗体复合物也带上荧光探针刀。2.2对感染及其治疗效果进行观察由于T淋巴细胞在人免疫

9、系统中承担着重要功能，故当感染发生时，T淋巴 细胞各亚群的变化很敏感地反映感染的状态与程度，FCM对淋巴细胞各亚群的 测定可有助于对感染的诊断及疗效的动态观察，比传统方法更快捷、更真实、更 具统计意义。已有作者报道了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值，并对其种族、性别、年 龄等影响因素进行了探讨。同样此种测定技术也可用于感染及其治疗效果观 察，如HIV主要侵袭CD4+T细胞而导致CD4淋巴细胞减少，CD4/CD8淋巴细 胞比值下降，为艾滋病的诊断和治疗提供依据9,10。在其它免疫功能性疾病的诊 治方面如系统性红斑狼疮（SLE）患者的淋巴细胞变化可反映该病的活动情况和器 官侵犯程度。伴有严重肾脏损害

10、的SLE患者可出现低CD4+、高CD8+的现象凹。 2.3细胞内和体液中细胞因子的测定细胞因子既是免疫系统的信息传递介质，又是神经、内分泌及其他系统和免 疫系统相互联系的重要桥梁。正常情况下，细胞因子的表达和分泌受到机体严格 地调控。在病理状态下，细胞因子会出现异常表达。因此，检测细胞因子对于某 些疾病的诊断、治疗具有重要价值。FCM检测在活化免疫细胞内细胞因子时，可以从单细胞水平检测不同细胞 亚群中产生的细胞因子，不仅能了解细胞中细胞因子的量和产生细胞因子的细胞 类型，还能了解细胞内细胞因子产生的动力学。其主要通过细胞因子特异的单克 隆抗体进行细胞内免疫荧光染色，并结合膜表面抗原染色，用多色

11、FCM分析 各种细胞内合成的细胞因子，并可根据各类细胞所产生细胞因子种类的差别，对 免疫细胞进行分类。3.流式细胞术在其他领域的应用：FCM可用于对器官或骨髓移植病人进行监控，指导抗感染及免疫抑制剂的 使用；还可对其他免疫功能性疾病如系统性红斑狼疮病人，强直性脊髓炎US 变态反应J胜疾病、肾病综合征等进行检测与疗效观察。FCM不仅在肿瘤学、 血液学、细胞免疫学等方面有着重要的应用，在细胞生物学、分子生物学、遗传 学病理学、药理学、微生物学等学科中也有重要应用。随着FCM的应用及推广， 相信FCM能对现代生物学及生物学技术的发展作出重大的贡献。3.1细胞生物学定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时

12、相的细胞；分析生物大分子如DNA、 RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分 析，并可纯化X或Y染色体。3.2肿瘤学DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测 定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探 测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。肿瘤疾病的诊断和血液系统疾病的检查与分型是利用各种标本中细胞DNA 含量的测定，可以帮助诊断或鉴别良恶性肿瘤。免疫表型对于急性白血病的诊 断、分型、预后判断、检测微小残留病变及预测复发具有重要的意义13。3.3血液学血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞

13、中各种酶的定量分析， 如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成 熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh ( +)或抗3抗原阳性细胞，以 了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可 以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等；外周血或骨髓中造血干/祖细胞的检测， 对于移植供体及移植效果的判断有重要意义；血液中网织红细胞的检测，可用于 判断贫血的类型、治疗效果等；血液中血小板数量和功能的检测，对于血小板减 少症患者的诊断及治疗、预后判断有着积极意义；可能出现在血液中的其它一些 稀少细胞(如内皮细胞、转移的肿瘤细胞等)的计数等。3.4

14、药物学检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗 药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。3.5分子生物学流式细胞技术可在单细胞水平进行基因的表达、调控及功能等研究。如近年 发展起来的流式分子表型分析(Molecular Phenotyping)，该技术是指用流式 细胞技术检测细胞中特异性核酸序列或特异性基因异常。流式分子表型分析与免 疫表型分析技术相结合，对于检测所选择细胞亚群的特异性核酸序列(如癌基因、 病毒核酸等)检测，提供了一种非常有用的工具，具有广阔的应用前景。4.小结：FCM检测技术对于细胞免疫功能的评价发挥着重要的作用，其发展

15、趋势可 归纳为：流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台 式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；对流式细胞术检测荧光参数， 从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15种荧光信 号; 从检测参数的相对定量发展为绝对定量；从检测参数的手动人工分析发 展为利用计算机软件的自动分析；所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配 套的试剂盒试剂。流式细胞术不仅已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞 遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，还可以通过定量流式细胞分 析，精确定量分析细胞功能的微小变化，对于预测、监测艾滋病等传染病有着重 要的意义和发

16、展潜力。然而，一些FCM检测技术在方法学和抗体选择上还没有 统一，分析结果亦存在多种影响因素，如样本与试剂准备、免疫荧光染色方法、 对照设置、流式细胞数据的获取与分析等。只有充分了解这些影响因素，建立标 准化的操作程序并做好严格的质控，才能保证检测结果准确、可靠。相信，随着 流式细胞仪性能的不断改进和测定方法与技术的快速发展，FCM将为临床免疫 等实验研究发挥更重要的作用。参考文献1李嘉彦，车绪春.流式细胞仪在医学研究与检验工作中的应用J.广东医 学，2004，25(1): 96-98.刘亮.流式细胞术在肿瘤免疫学中的应用J .经验交流Experience， 2012,9(18):4648.王

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