α-淀粉酶在介孔分子筛MCM-41上的固定化研究资料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。-淀粉酶在介孔分子筛MCM-41上的固定化研究硕士学位论文-淀粉酶在介孔分子筛MCM-41上的固定化研究Theimmobilizationof-amylaseonthemesoporousmolecularsievesMCM-41作者姓名：王亮亮学号：2010924300学科专业：工业催化研究方向：催化精细有机合成指导教师：宋伟明教授、邓启刚教授答辩日期：2013年05月齐齐哈尔大学QiqiharUniversityM.D.DissertationofQiqiharUniversityTheimmobi

2、lizationof-amylaseonthemesoporousmolecularsievesMCM-41Name：liangliangwangStudentID：2010924300Specialty：IndustrialCatalysisResearchDirection：CatalyticfinesynthesisSupervisor：WeimingSongQigangDengDateofOralExamination：May,2013QiqiharUniversity齐齐哈尔大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，

3、除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：-淀粉酶在介孔分子筛MCM-41上的固定化研究作者签名：日期：年月日摘要介孔分子筛MCM-41具有均匀的一维孔道，呈六方有序规整排列和窄的孔径分布以及大的比表面积，且吸附量大，可作为优良的载体材料，用于酶的固定化。-淀粉酶（-1,4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶）普遍存在于微生物和动植物中，是一种重要的淀粉水解酶。它可随机地切断糖原、淀粉、

4、寡聚糖或多聚糖分子内的-1,4-糖苷键，生成还原性糖，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。目前，已广泛应用于各行各业之中。本文以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为模板剂，正硅酸乙脂（TEOS）做硅源在碱性条件下通过水热法合成MCM-41介孔分子筛。以此为载体，分别采用物理吸附法、吸附-交联组合法以及对MCM-41进行环氧基改性后的共价结合法对-淀粉酶进行固定化研究。分别研究了不同的固定化条件对固定化酶活性回收率的影响，并对固定化酶的活性、稳定性、结构等进行了研究。分别测定了不同固定化方法的固定化时间、给酶量、pH等固定化条件对固定化酶的活性回收率的影响，得出较佳固定化

5、条件为，物理吸附法：固定化时间为11h、给酶量为63mgg-1、pH=5.9的条件下，酶活回收率可达48；吸附交联组合法：吸附时间/交联时间为6/4.5（h），戊二醛溶液体积分数为4%，酶活性回收率达最大值为51%；共价结合法：固定化时间为21h，给酶量为5mgg-1，pH=6.5的条件下，固定化酶平均活性回收率可达26%。在此条件下制得的固定化酶与游离酶相比，固定化酶的pH稳定性、操作稳定性和储藏稳定性有了较大改善，有利于-淀粉酶的重复使用，大大提高了-淀粉酶的使用寿命。与此同时，对比三种不同固定化方法的优缺点，结果表明，稳定性：物理吸附法吸附-交联法共价结合法，活性：共价结合法物理吸附法吸

6、附-交联法。关键词：-淀粉酶；介孔分子筛MCM-41；固定化酶；吸附法；组合固定化法；环氧硅烷化；共价结合Theimmobilizationof-amylaseontheMCM-41mesoporousmolecularsievesAbstractMesoporousmolecularsieveMCM-41withhomogeneousone-dimensionalchannel,arearrangedorderlystructuredthesix-partyandnarrowporesizedistributionandlargerspecificsurfacearea,hasalargea

7、mountofabsorption,canbeusedasacarrierofthefinematerial,usedforenzymeimmobilization.-starchenzyme(-1,4-D-glucose-glucosidehydrolyticenzyme)commonlydistributeinplants,animals,andmicroorganism,whichisanimportantkindofstarchhydrolyticenzyme.Itcanberandomlycut-1,4-glycosidicbondinstarch,glycogen,andexces

8、ivepoly-sugarmolecular,generateareducingsugar,istheearliestimplementationandbyfarthemostwidelyusedindustrialproduction,yieldthelargestvarietiesofenzymepreparation.Atpresent,hasbeenwidelyusedinallwalksoflife.ThispaperpreparedtheMCM-41mesoporousmolecularsievebythehydrothermalsynthesismethodinalkalinec

9、onditionandthehexadecyltrimethylammoniumbromide(CTAB)isastemplateagent,orthosilicate(TEOS)ethylissiliconsource.Asthecarrier,immobilizedstudyon-starchenzymebyepoxygroupofphysicaladsorption,adsorption-paytransmittewithMCM-41.Westudiedtheinfluenceonrecoveryrateofimmobilizedenzymeactivityindifferentimmo

10、bilizedconditions,andtheactivity、stabilityandstructureofimmobilizedenzyme.Weredeterminedatdifferentimmobilizationmethodsofimmobilizationtime,enzymeamount,pHandimmobilizedconditionsontheinfluenceoftheenzymeactivityrecovery,obtainedbetterimmobilizedconditionsfor,physicaladsorptionmethod：immobilization

11、timeis11h,totheamountofenzymeis63mgg-1,pH=5.9,undertheconditionofenzymeactivityrecoveryratecanreach48%;Theadsorptionandcrosslinkingcomposedmethod:adsorptiontime/crosslinkingtime6/4.5(h),thevolumefractionofglutaraldehydesolution4%,enzymeactivityrecoveryrateuptoamaximumof51%;Covalentbondingmethod:immo

12、bilizedfor21h,totheamountofenzymeis5mgmgg-1,undertheconditionofpH=6.5,theimmobilizedenzymeactivityrecoveryrateofupto26%onaverage.Thepropertiesofimmobilizedenzymeinthebestimmobilizedconditionwereimprovedthanfreeenzyme,suchaspHstability,operationstabilityandstoragestabilityhaveimprovedlargely,Whichare

13、helpfulfortherepeateduseof-amylaseandgreatlyimprovingtheusinglifeof-amylase.Meanwhile,thecomparativestudyofadvantagesanddisadvantagesofthethreedifferentimmobilizedmethodwasdone,theresultofstability:physicaladsorptionmethodadsorption-crosslinkingmethodcovalentbonding,active:covalentbondingphysicalads

14、orptionmethodadsorption-crosslinkingmethod.KeyWords：-amylase；MesoporousmolecularsievesMCM-41；Immobilizedenzyme；Adsorptionmethod；Combinationimmobilizedmethod；Epoxysilanization；Covalentbonding目录TOCo1-3hzuHYPERLINKl_Toc357715300摘要PAGEREF_Toc357715300hIHYPERLINKl_Toc357715301AbstractPAGEREF_Toc357715301

15、hIIHYPERLINKl_Toc357715302引言PAGEREF_Toc357715302h1HYPERLINKl_Toc3577153031文献综述PAGEREF_Toc357715303h2HYPERLINKl_Toc3577153041.1固定化酶的概述PAGEREF_Toc357715304h2HYPERLINKl_Toc3577153051.1.1固定化酶的定义PAGEREF_Toc357715305h2HYPERLINKl_Toc3577153061.1.2固定化酶的优缺点PAGEREF_Toc357715306h2HYPERLINKl_Toc3577153071.2酶的固定

16、化方法PAGEREF_Toc357715307h2HYPERLINKl_Toc3577153081.2.1吸附法PAGEREF_Toc357715308h3HYPERLINKl_Toc3577153091.2.2共价结合法PAGEREF_Toc357715309h4HYPERLINKl_Toc3577153101.2.3交联法PAGEREF_Toc357715310h4HYPERLINKl_Toc3577153111.2.4包埋法PAGEREF_Toc357715311h5HYPERLINKl_Toc3577153121.2.5新型固定化方法PAGEREF_Toc357715312h6HYPE

17、RLINKl_Toc3577153131.3固定化酶的应用PAGEREF_Toc357715313h6HYPERLINKl_Toc3577153141.3.1在食品工业的应用PAGEREF_Toc357715314h6HYPERLINKl_Toc3577153151.3.2医学和临床分析PAGEREF_Toc357715315h6HYPERLINKl_Toc3577153161.3.3生物传感器方面的应用PAGEREF_Toc357715316h7HYPERLINKl_Toc3577153171.3.4在环境保护中的应用PAGEREF_Toc357715317h7HYPERLINKl_Toc3

18、577153181.4评价固定化酶活性的指标PAGEREF_Toc357715318h8HYPERLINKl_Toc3577153191.4.1固定化酶的活性PAGEREF_Toc357715319h8HYPERLINKl_Toc3577153201.4.2固定化酶的酶活性回收率PAGEREF_Toc357715320h8HYPERLINKl_Toc3577153211.4.3相对活性PAGEREF_Toc357715321h8HYPERLINKl_Toc3577153221.4.4固定化酶的半衰期PAGEREF_Toc357715322h8HYPERLINKl_Toc3577153231.4

19、.6固定化酶的稳定性PAGEREF_Toc357715323h8HYPERLINKl_Toc3577153241.5介孔分子筛MCM-41及-淀粉酶的概况PAGEREF_Toc357715324h9HYPERLINKl_Toc3577153251.5.1介孔分子筛MCM-41PAGEREF_Toc357715325h9HYPERLINKl_Toc3577153261.5.2-淀粉酶概况PAGEREF_Toc357715326h10HYPERLINKl_Toc3577153271.5.3-淀粉酶固定化的研究进展PAGEREF_Toc357715327h11HYPERLINKl_Toc357715

20、3281.6本课题研究的意义及内容PAGEREF_Toc357715328h11HYPERLINKl_Toc3577153292实验部分PAGEREF_Toc357715329h12HYPERLINKl_Toc3577153302.1实验材料PAGEREF_Toc357715330h12HYPERLINKl_Toc3577153312.1.1实验试剂PAGEREF_Toc357715331h12HYPERLINKl_Toc3577153322.1.2实验仪器PAGEREF_Toc357715332h12HYPERLINKl_Toc3577153332.2溶液的配置PAGEREF_Toc3577

21、15333h13HYPERLINKl_Toc3577153342.2.1磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制PAGEREF_Toc357715334h13HYPERLINKl_Toc3577153352.2.2-淀粉酶溶液的配制PAGEREF_Toc357715335h14HYPERLINKl_Toc3577153362.2.3可溶性淀粉溶液的配制PAGEREF_Toc357715336h14HYPERLINKl_Toc3577153372.2.4标准麦芽糖溶液的配制PAGEREF_Toc357715337h14HYPERLINKl_Toc3577153382.2.53,5-二硝基水杨酸试剂的配制PA

22、GEREF_Toc357715338h14HYPERLINKl_Toc3577153392.3介孔分子筛的制备PAGEREF_Toc357715339h14HYPERLINKl_Toc3577153402.3.1介孔分子筛MCM-41的制备PAGEREF_Toc357715340h15HYPERLINKl_Toc3577153412.3.2介孔分子筛MCM-41的环氧硅烷化PAGEREF_Toc357715341h15HYPERLINKl_Toc3577153422.4-淀粉酶的固定化PAGEREF_Toc357715342h15HYPERLINKl_Toc3577153432.4.1吸附法固

23、定化-淀粉酶PAGEREF_Toc357715343h15HYPERLINKl_Toc3577153442.4.2吸附-交联组合固定化-淀粉酶PAGEREF_Toc357715344h16HYPERLINKl_Toc3577153452.4.3共价结合法固定化-淀粉酶PAGEREF_Toc357715345h16HYPERLINKl_Toc3577153462.5-淀粉酶活性的测定PAGEREF_Toc357715346h16HYPERLINKl_Toc3577153472.5.1-淀粉酶活性的测量原理PAGEREF_Toc357715347h16HYPERLINKl_Toc357715348

24、2.5.2游离-淀粉酶活性的测定PAGEREF_Toc357715348h17HYPERLINKl_Toc3577153492.5.3固定化-淀粉酶活性的测定PAGEREF_Toc357715349h18HYPERLINKl_Toc3577153502.6载体及固定化酶的表征PAGEREF_Toc357715350h18HYPERLINKl_Toc3577153513结果与讨论PAGEREF_Toc357715351h20HYPERLINKl_Toc3577153523.1介孔分子筛MCM-41吸附固定化-淀粉酶PAGEREF_Toc357715352h20HYPERLINKl_Toc3577

25、153533.1.1固定化条件的确定PAGEREF_Toc357715353h20HYPERLINKl_Toc3577153543.1.2固定化酶的性质PAGEREF_Toc357715354h23HYPERLINKl_Toc3577153553.1.3载体及固定化酶的表征PAGEREF_Toc357715355h26HYPERLINKl_Toc3577153563.1.4小结PAGEREF_Toc357715356h29HYPERLINKl_Toc3577153573.2MCM-41吸附-交联组合固定-淀粉酶PAGEREF_Toc357715357h29HYPERLINKl_Toc35771

26、53583.2.1固定化条件的影响PAGEREF_Toc357715358h30HYPERLINKl_Toc3577153593.2.2固定化酶性质的比较PAGEREF_Toc357715359h31HYPERLINKl_Toc3577153603.2.3载体和固定化酶的结构分析PAGEREF_Toc357715360h33HYPERLINKl_Toc3577153613.2.4小结PAGEREF_Toc357715361h35HYPERLINKl_Toc3577153623.3环氧硅烷化MCM-41分子筛共价固定-淀粉酶PAGEREF_Toc357715362h35HYPERLINKl_To

27、c3577153633.3.1-淀粉酶在K-MCM-41上的固定PAGEREF_Toc357715363h35HYPERLINKl_Toc3577153643.3.2固定化酶的性质PAGEREF_Toc357715364h38HYPERLINKl_Toc3577153653.3.3固化酶前后分子筛的结构表征PAGEREF_Toc357715365h41HYPERLINKl_Toc3577153663.3.4小结PAGEREF_Toc357715366h45HYPERLINKl_Toc357715367结论PAGEREF_Toc357715367h46HYPERLINKl_Toc35771536

28、8参考文献PAGEREF_Toc357715368h48HYPERLINKl_Toc357715369致谢PAGEREF_Toc357715369h51引言酶是由生物体活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质，是一种非常重要的生物催化剂，具有一般催化剂的特性，与此相比，酶具有反应条件比较温和、催化效率高且污染小等优点。生物体内的各种化学反应都是在酶催化下进行的，而酶的本质是蛋白质。游离酶很不稳定，一般催化作用都是一次性。酶对酸、碱、热及有机溶液等不稳定，易变性失活。由于酶易溶于水等溶剂，在催化反应时，部分酶会残留在溶液中，不容易分离回收，降低了产品质量，增大了提纯成本。游离酶的这些不足，大大限

29、制了其酶促反应的广泛应用。为了解决这些问题，二十世纪60年代出现的固定化酶技术。固定化酶是指将酶束缚在一定的区域内，并仍能保持酶的基本结构和催化性质，且可以回收和重复使用的一类技术。此方法与游离酶相比，不仅具有游离酶的特性，还易于分离回收、多次重复使用、稳定性提高，大大增加了酶的使用寿命。拓展了酶的使用范围。随着酶固定化技术的不断提高，进一步促进了酶工程的发展。固定化酶的性质是由合成固定化酶的方法和载体性能所决定的，同一种酶在不同的载体上固定其性能不一，为了寻找合适的载体，使其制备出的固定化酶具有较高酶活性和高稳定性，研究者们都作出很多努力。SiO2介孔分子筛具有高的机械强度、好的稳定性、孔道

30、均一和具有较大的比表面积等特点，可以作为优良的固定化酶载体。制备出合适的载体，合成固定化酶的关键问题在于，寻找出影响固定化酶活性的各种因素，并针对每一个因素进行一一探讨分析，找出酶活性与各固定化影响因素之间的关系，为固定化酶的制备与开发提供可靠的依据。1文献综述酶是一种有有氨基酸组成的蛋白质，其结构对环境十分敏感，各种物理因素（如温度、压力等）、化学因素（如pH值、金属离子等）和生物因素都可能使酶丧失生物活性。酶在反应过程中，随着反应时间的延长，速率会逐渐下降。反应后酶不能回收，产物分离纯化较复杂。限制了现代工业中酶催化的应用。为了更好地发挥酶的催化功能，人们针对酶的不足寻求其改善方法。其办法

31、之一就是固定化技术的应用。1.1固定化酶的概述1.1.1固定化酶的定义固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项新技术。直到1969年固定化氨基酸酸化酶才被工业生产正式应用。在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式采用固定化酶。固定化酶，是用固体材料将酶束缚或限制在一定区域内，仍能保持其特有的催化活性，并可回收和重复利用的一类技术。该技术是现代生物技术及其工业化环节中的一个核心技术。自20世纪50年代以来，固定化酶的材料、技术和理论得到了迅速发展。当前重点逐步放在用适当的固定化技术来改善酶的催化性能。因此，在某种意义上固定化酶技术已经成为酶的基因工程的互补技术。1.1.2固定化酶的优缺点固定化

32、酶与游离酶相比，其优点如下：1）易将固定化酶和底物、产物分开，产物中没有酶的残留，简化了产物的分离纯化工艺；2）能在较长时间内反复进行分批反应或装柱连续反应，提高了酶的使用效率；3）在多数情况下，能够提高酶的稳定性。固定化酶也存在一些缺点：1）酶在固定化过程中，有酶活力的损失；2）多了固定化过程，也就增加了生产的成本，工厂初始投资增大；3）只能用于可溶性底物，而且只对小分子底物较为适用。4）酶在固定化之前，必须经过酶的分离提纯过程，同样也增加了成本。1.2酶的固定化方法目前，已然发现的酶有数千种，固定化酶的应用目的和应用环境各不相同，且用于固定化酶的材料多种多样，因此酶固定化方法很多，没有任何

33、一种方法适用于所有的酶，同时，也没有任何一种酶适用于所有方法。酶固定化的基本方法可粗略分为5种，即吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。而这些原始的方法组合已经形成了数百种方法。方法的合理组合常常能够解决由单一方法无法解决的问题，如酶可先被交联形成稳定的酶制剂，随后通过包埋使具有适当粒度和高机械稳定性。1.2.1吸附法通过氢键、疏水键和电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法，简称为吸附法。吸附法制备固定化酶，条件温和，操作简便，引起酶变性失活概率相对较小，载体较廉价易得，且可反复使用。但因为靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固，容易脱落，所以使用受到限制。通常，吸附法分为物理

34、吸附法和离子吸附法。1）物理吸附法：物理吸附法是将酶蛋白通过范德华力、氢键、疏水作用和静电作用等相互作用，吸附在不溶于水的载体表面上，而使酶固定化。此法与共价结合法相比，酶蛋白的活性中心不易受到破坏，酶的结构变化也不明显，从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，但缺点是酶与载体的相互作用力较弱，所以被吸附的酶易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶1。刘平等2系统的研究了4种不同蛋白酶在不同分子筛上的吸附固定化。结果显示,酶本身的性质和分子筛的结构对固定化酶的活性有重大影响,而且不同的吸附固定化条件，如pH、固定化时间、酶的浓度等因素，对吸附固定化酶活性也有显著的影响。孙伟杰等3

35、以介孔分子筛SBA-16为载体，采用物理吸附的方法对木瓜蛋白酶进行了固定化。2）离子吸附法：离子吸附法是酶通过离子间吸附于具有离子交换基的不溶性载体上的方法。能用于此法的载体有：阴离子交换剂如DEAE-纤维素等，阳离子交换剂如CM-纤维素等。离子吸附法操作简单，处理条件温和，酶的活性中心和高级结构的氨基酸残基不易被破坏，能够得到较高活性回收率的固定化酶。该方法与共价结合法相比，酶和载体之间的结合力是依靠库仑力作用，结合力弱，不够牢固，易受反应液pH值及缓冲液种类的影响。在较高溶液离子强度下反应时，酶往往会从载体上脱落下来。廖春燕4以D301大孔阴离子树脂为载体，采用离子交换吸附法固定化-淀粉酶

36、，得到稳定性较好的固定化酶。徐娟等5选择以D380大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为载体，通过先吸附后交联的方法固定化-淀粉酶，并对固定化酶的酶学性质作了初步研究。1.2.2共价结合法共价结合法是指酶蛋白分子的功能团和载体表面上的反应基团之间以共价键相互连接，形成固定化酶。酶分子中能与载体形成共价键的主要功能团有：羧基、氨基、巯基、羟基、酚基、咪唑基和吲哚基等。最常见的为羧基、氨基、组氨酸和酪氨酸的芳环。要使载体与酶形成共价键，首先必须使载体活化，即在载体上引入某一活泼基团。此活泼基团能与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。而不同载体其活化的方法不同，主要有重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷基化法等

37、，其中以介孔分子筛为例的活化方法主要是烷基化法，如图1.1。图1.1介孔分子筛烷基化Fig.1.1Mesoporousmolecularsievesalkylation共价结合法使用广泛，酶与载体连接牢固，不易脱落，有良好的稳定性及重复实用性。缺点是反应条件较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损6。王富科7、王宝康8、玄光善等9分别以甘蔗纤维素衍生物、多孔玻璃微珠ZXBL和TCBL、尼龙作为栽体，用共价结合法固定-淀粉酶，确定了其最佳固定条件和最佳应用条件，并研究了固定化酶的性质。与游离酶相比，其稳定性都有明显提高。1.2.3交联法交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶

38、分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构。例如戊二醛交联，其反应如1.2图所示。在交联反应过程中不仅存在酶分子之间的交联，而且还存在着部分酶分子内的交联。一般酶分子参与交联反应的功能团有N末端的-氨基、赖氨酸的-氨基、组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。正因为酶分子蛋白的这些功能团参与了反应，所以酶分子的活性中心和高级结构可能受到影响而使酶显著失活。固定化酶在制备过程中不同的制备条件和添加的材料不同，得到的固定化酶其物理性质也有差别。利用多功能试剂制备固定化酶的方法主要有：1)单独和酶作用；2)酶被吸附在载体表面后再进行交联；3)载体与多功能团试剂反

39、应得到带有功能团的功能载体，再与酶作用。作为交联剂的试剂很多，而戊二醛是最常用的，其他有异氰酸衍生物、双偶氮联苯、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸、己二酰亚胺酸二甲酯等。此法优点是酶之间连接牢固，具有良好的稳定性及重复使用性。缺点是难以很好的控制反应条件，反应剧烈，常常引起酶蛋白的高级结构发生变化。并导致活性中心受到破坏，从而难于保证每次都能制得高活力的固定化酶。此法很少单独使用，一般将其作为其他固定化方法的辅助手段10。图1.2戊二醛交联Fig.1.2Glutaraldehydecrosslinking蒋珍菊等11以具有生物活性的壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂来固定化a-淀粉酶，探索了固定化的最佳

40、条件。赵昆，张良等12以实验室分离保存的葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterintermedius)G-29摇瓶培养产生的细菌纤维素微球作为载体，采用戊二醛交联法固定化-淀粉酶。1.2.4包埋法包埋法是指将酶分子或其他生物催化剂限制在某一区域内的载体中，通过把催化组分分散到流体介质中，然后利用某种方法形成含有酶的或其他生物催化剂的不溶性载体。包埋法是继共价结合法和吸附法之后第三种固定化的方法。这种方法还具备能同时固定多种酶的特征13。包埋法一般不用与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，反应条件温和，很少改变酶的高级构象，酶的活性回收率较高，许多酶都可以用该方法进行固定化。包埋法制备固定化

41、酶，由于受载体孔径的限制，一般只适用于固定催化小分子底物的酶，原因是只有小分子底物，才能通过高分子凝胶的网格进行反应。此外，由于包埋法产生的这种扩散阻力的影响，会使固定化酶的动力学常数发生改变，从而影响酶的活力。黄铃14以琼脂作为栽体村料，采用包埋法固定化a-淀粉酶，并对其持性进行了研究。唐鹏程，焦士蓉等15以海藻酸钠、卡拉胶共混包埋制备固定化a-淀粉酶，并对理一淀粉酶固定化条件和固定化酶性能进行了探讨。1.2.5新型固定化方法利用当代高新技术，设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。开发新型酶固定化方法的原则是：实现在较温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失。

42、通过等离子体、辐射、超声波等新方法均可制备高活性固定化酶。Puleo等16将钛合金等离子体处理后，先经琥珀酸酐处理（或者将钛合金Ti-6Al-4V表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基），再经含碳硝化甘油接枝，然后再将骨形态蛋白和溶菌酶进行固定，从而实现了生物酶分子在惰性金属上的固定化。Li等17利用含芳香叠氮基的光活性酯在远紫外光的辐射下，光解叠氮基生成了氮烯和在PES膜表面上的C-H键之间发生插入反应形成的仲胺，再将尿酶共价结合到PES膜的表面。利用超声波使高分子主链均裂产生自由引发功能性单体，再聚合成嵌段共聚物载体固定化酶的研究结果表明，借助现代技术可使一般性聚合物经功能化改性成为新的酶固定

43、化载体。1.3固定化酶的应用以应用为目的并在应用中不断完善和发展是酶固定化研究的鲜明特色。目前，已能够制备多种高活性和高稳定性的固定化酶，随着其应用范围的不断扩大，在常用的固体催化剂中固定化酶已然占有了一定的地位。固定化酶已广泛应用于医药、食品、轻工等领域，在精细有机合成、临床分析和微量有害物质检测方面的应用也在不断扩张。1.3.1在食品工业的应用酶固定化技术在食品行业最早发展起来的一个领域，其中最著名、规模最大的就是利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆18。还有应用固定化L-天冬酶从富马酸铵生产天冬氨酸等。将固定化酶法应用于果蔬饮料及茶饮料生产中，可以提高适口性、营养价值以及去除异味的效果。有

44、报道显示，可将固定化的漆酶用于儿茶酸的去除和苹果汁的澄清。此外，研究发现，固定化的果胶酶可以提高果汁的澄清度、过滤效率和榨汁率。刘新颖等19以海藻酸钠为载体，利用交联-包埋-交联的方法共固定化了-葡萄糖苷酶和单宁酶，可应用于茶饮料的增香和除浑处理。有学者从黑曲霉的发酵液中提取了-葡萄糖苷酶酶液，将其固定在丝素蛋白上，此固定化酶可用于改良茶汁的风味。因啤酒在长期的储存过程中，其含有的多酚和多肽物质发生聚合反应使啤酒变浑浊。利用固定化木瓜蛋白酶处理啤酒，得到的啤酒在长期的储存中可保持稳定20。1.3.2医学和临床分析自1893年FRANCIS利用木瓜蛋白酶治疗了结核性溃疡和白喉的假膜，酶在医学治疗

45、上的应用开始被人们关注。现如今人们已经将酶作为药物，在外科、内科、妇科、眼科、放射科等临床方面，广泛地得到应用，取得了良好的治疗效果。药用的酶主要是可通过固定化提高其稳定性及缓释性，并可出去免疫原性，以起到更好的疗效。前列腺素衍生物作为药物，是将其固定在载体N-聚氨乙基丙烯酰胺上，制成固定化酶，显示出了良好的稳定性及活性。在卫生防疫和临床检测方面也广泛应用了微囊固定化的过氧化氢酶。ATP是生物能量的储备形式、细胞代谢活动的能量来源，利用萤火虫荧光素酶(fire-flyluciferase)可以检测三磷酸腺苷(ATP)的含量。萤火虫荧光素酶在催化发光反应中ATP是不可替代的专一性底物。利用荧光强

46、度和ATP浓度的关系，可以快速准确监测生物体的生理状态导致的ATP含量的变化。将anti-AFP酶制成一种免疫测定系统，分析其作用原理，并预期能在临床上有广泛的应用21。将漆酶固定在生物传感器上制成酶电极，检测药物扑热息痛(paracetamol)22。用聚丙烯酰胺包埋葡萄糖氧化酶与氧电极组装成酶电极也可用来进行临床的血糖监测。1.3.3生物传感器方面的应用生物传感器是利用生物物质作为识别元件将被测物的浓度与可测量的电信号关联起来的装置。生物传感器中研究最多的是酶传感器，其核心是技术也是酶的固定化。生物传感器技术的发展很快实现了食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，提高了食品质量和安全可靠

47、性。JPang23、ANJANKB24、MartaT25、WeiQF26都是将酶固定化后制成生物传感器，用于测定某一物质的含量。生物传感器在医学领域，由于其快速简单、响应快、灵敏、专一等优点被得到广泛认可，并应用越来越广泛。高精度血糖分析仪是采用固定化酶的生物传感分析仪，其分析精度一般可以达到0.5-227，如用聚丙烯酰胺包埋葡萄糖氧化酶与氧电极组装成酶电极也可用来进行临床的血糖监测。1.3.4在环境保护中的应用随环境污染的日趋严重及其治理的日益迫切，固定化酶在环境科学领域将具有重要用途。固定化酶在环境方面的应用主要有两个方面，一个是环境监测，一个是污水处理。在环境监测方面，可以利用固定化酶测

48、定一些有毒物质的含量，以达到环境监测的效果。在污水处理方面，是利用酶处理废水中一些有毒有害物质，防止污染。因此固定化酶在环境保护方面受到了越来越多科学家的关注。生活污水和工业废水中有害成分主要是酚类化合物。美国宾夕法尼亚大学将多酚氧化酶制成固定化酶柱，可以检测出水中210-5g/L的酚。美国科学家则报道了二氧化硅凝胶为载体的固定化酶传感器可以监测大气中二氧化碳的含量变化。王安明等28以膜状壳聚糖为载体吸附过氧化氢酶，与过氧化氢电极结合对低浓度臭氧达到了简便快速检测。在废水处理中，其中漆酶的固定化应用较为广泛，废水中有害成分主要是酚类化合物，漆酶可以催化氧化酚类化合物，而且不用加入过氧化物酶。脱

49、乙酰壳多糖胶膜固定的苯丙氨酸酶可将苯酚降解，而且脱乙酰壳多糖胶膜可以快速将产物吸附，极大地提高了污水处理的效率。日本有人用固定化的淀粉酶处理淀粉废水和造纸废水。1.4评价固定化酶活性的指标1.4.1固定化酶的活性固定化酶的活性是以反应初速率来表示的，即单位重量的固定化酶单位时间内催化某一特定化学反应生成产物的量来表示。1.4.2固定化酶的酶活性回收率1.4.3相对活性酶的相对活性是指在同组试验中相对于活性最大的那个而言，与之比值称之为相对活性，通常以百分数表示。1.4.4固定化酶的半衰期在连续催化反应条件下，固定化酶活性降低到初始酶活的一半所用的连续反应时间为固定化酶的半衰期，用t1/2表示。

50、半衰期能够衡量固定化酶的使用寿命。测量固定化酶的半衰期，可以进行长期实际操作来确定，这种方法与化工催化剂半衰期的测量方法相似，可以利用较短时间的操作便能够推算出来。假定活性损失与时间成指数关系，半衰期可如下式表达：tl/2为半衰期(酶活性达原始酶活性一半的时间)，t为连续反应时间，E0为原始酶活，E为酶活(t时)。1.4.6固定化酶的稳定性酶的稳定性是关系到固定化酶能否实际应用的重大问题，是指固定化酶能否长期稳定操作和使用。大部分固定化酶的稳定性与溶液酶相比有不同程度的提高，延长了使用寿命。固定化酶的稳定性一般可分为：热稳定性、操作稳定性和储存稳定性。热稳定性通俗讲是指酶的耐热能力大小、范围以

51、及在一定温度下保持较高活性的时间。酶作为生物催化剂，与一般化学催化剂一样，温度越高，反应速率越快，但是酶的本质是蛋白质，对温度敏感，温度过高以及在一定温度反应时间过长将严重降低其活性，甚至失活。而固定化酶耐热性一般有所提高，使酶能够适应更高的温度，提高其使用温度范围和使用时间。操作稳定性是指在操作过程中保留其活性的能力。只有经长期操作使用后，任然能保持较高活性的固定化酶才具有工业应用价值。储存稳定性是指酶保持活性的储存时间，一般酶在储存过程中酶的活性会逐渐下降，但也有特殊情况，据报道，有些固定化酶，经储存后，反而提高了其活性。一般固定化酶的储存稳定性都有所增强，但也有一些固定化酶储存稳定性下降

52、。1.5介孔分子筛MCM-41及-淀粉酶的概况1.5.1介孔分子筛MCM-41介孔分子筛MCM-41是有序介孔材料，是一种新型的纳米结构材料，具有孔道呈六方有序排列、大小均匀、纳米级孔径、比表面积大等特点。介孔材料MCM-41的显著结构特征及性质在于：(1)长程结构有序；(2)比表面大；(3)孔径在一定范围内可调；(4)孔隙率高；(5)骨架组成可调变性；(6)表面富含弱酸性硅端经基。介孔分子筛MCM-41具有的这些独特性质是其它无定型材料和微孔分子筛所不具有的，由其结构特点及性质派生的应用性能也是其它材料所无法比拟的。1）介孔分子筛作为酶固定化载体的优越性曾有文献报道过在介孔分子筛MCM-41

53、上进行木瓜蛋白酶，脂肪酶等的固定。结果显示介孔分子筛MCM-41是酶固定化的优良载体。其优点主要表现在：（a）MCM-41具有纳米级孔径，且分布均一，可以充分发挥对分子形状及大小的选择性；与微孔分子筛相比，MCM-41较大的孔径可以使大体积分子易于负载在其表面的活性基团上；介孔分子筛的孔径可调，可适用于体积大小范围较宽的客体分子。（b）对于反应活性较高的羟基基团，其本身可直接作为功能性基团，而反应活性较弱的羟基基团，可利用介孔分子筛表面的可修饰性，通过有机硅烷与羟基的相互作用使介孔分子筛表面功能化。（c）介孔分子筛的表面富含弱酸性的羟基基团，不仅羟基基团的数量及其在表面的分布可根据目标进行调变

54、，而且表面羟基的性质可在合成过程中通过改变骨架组成或在合成后改性进行调变。（d）介孔分子筛在酶催化反应过程中，表面呈惰性。（e）介孔分子筛具有高的比表面积，理论负载量较高。2）介孔分子筛为载体的固定化酶研究状况近年来，随着介孔分子筛制备技术的日臻成熟，人们正在考虑用其担当固定化酶的载体。与其它材料相比，介孔分子筛规则的孔道、大的比表面积、极强的吸附性能、稳定的结构等特点，使其具有担当固定化酶载体得天独厚的优势。常见的用于固定化酶的介孔分子筛有MCM型。如赵炳超等29以介孔分子筛MCM-48为载体，戊二醛为交联剂对木瓜蛋白酶进行了固定化。结果表明有，与游离酶相比，固定化酶的热稳定性有了显著的提高

55、，其半衰期提高了30倍以上。固定化酶的PH稳定性和储存稳定性也有了明显改善。此外，固定化酶还具有很好的操作稳定性；肖宁等30以介孔分子筛MCM-41作为载体。戊二醛作为交联剂，对胰蛋白酶进行了固定化。研究了固定化条件对酶活性及酶活性回收率的影响，并对固定化酶的热稳定性和操作稳定性做了初步探讨。结果表明：都有了显著提高。而与MCM-48、SBA-16、SBA-15型介孔分子筛相比，MCFS(msoporescelluarfoam)具有大的孔径和高的装载量，因此也有人采用它作为固定化酶的载体。如高振源等31通过在分子筛MCFs合成过程中加入NH4F后，嫁接法合成了氟离子改性和表面环氧功能化的MCF

56、s泡沫状介孔分子筛，然后用于青霉素酰化酶的固定化，结果表明：用氟离子改性的MCFs介孔分子筛制备的固定化酶得到了目前文献报道最高的表观活性，操作稳定性得到了大幅度地提高；而用-(2,3)-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷在分子筛MCFs表面进一步嫁接环氧基机团后再固定化酶，得到的固定化酶其操作稳定性进一步提高，但活性较前者略有下降。1.5.2-淀粉酶概况-淀粉酶是一种水解酶，其国际酶学分类编号为EC.，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。-淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等，随机切开-1,4-糖苷键，生成糊精和还原性糖，由于产物的末端残基碳原子构型为A构型，所以称-淀粉酶。-淀粉酶广泛分布于

57、动植物及微生物体内。而微生物的-淀粉酶几乎都是分泌性的，且以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，作用于直链淀粉或支链淀粉，无差别地切断-1,4-链。其反应特征是使底物溶液粘度急剧下降和碘反应的消失，水解直链淀粉时最终产物以麦芽糖为主，以及少量的麦芽三糖和葡萄糖。在水解解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成了部分具有-1,6-糖苷键的-极限糊精。-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食和食品加工、发酵、纺织和医药行业等，它占了整个酶制剂市场份额的25%左右，是使用量最大的酶制剂。目前工业生产上主要以微生物发酵法大规模生产-淀粉酶。1.5.3-淀粉酶固定化的研究进展固定化酶在应用上和理论上的

58、巨大潜力吸引了诸多领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力，成为现代酶工程领域的研究热点。有关-淀粉酶的固定化在国内外已有许多报道，并在固定化载体、固定化方法、酶学特性及固定化酶反应器等方面取得了诸多进展。总结-淀粉酶的固定化研究，多采用硅藻土、壳聚糖、海藻酸钠、磁性高分子微球等载体进行固定化，也取得一定的效果32，但硅藻土、壳聚糖等载体比表面积相对较小，固定酶量有限，限制了其应用范围。以分子筛作为载体材料固定化-淀粉酶的研究较少，具有较好的应用潜力33。1.6本课题研究的意义及内容-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的淀粉水解酶，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大

59、的酶制剂之一。目前，-淀粉酶已经广泛应用到了变性淀粉以及淀粉糖、焙烤、酒精、发酵以及纺织等许多行业中，是一种非常重要的工业用酶。但由于游离的酶对环境十分敏感，易失活，使用周期短，且回收难等缺点严重影响了其使用效果，如将其固定化，改善其理化性质，提高其稳定性和重复使用率，能更好地发挥该酶的功效。为了更好地发挥酶的催化功能，人们针对酶的不足寻求其改善方法。其办法之一就是固定化技术的应用。将-淀粉酶固定化可提高其稳定性，使其对抑制剂敏感性降低，并可多次重复使用，从而提高酶的利用效率，降低生产成本。本课题研究的主要工作为如下三个方面：1)以介孔分子筛MCM-41为载体，利用物理吸附的方法固定-淀粉酶，

60、考察了吸附时间、给酶量和pH对-淀粉酶固定化性能的影响，并对固定化酶的活性、稳定性、载体结构等进行了研究。2)以介孔分子筛MCM-41为载体，利用吸附-交联组合固定化方法固定-淀粉酶。研究了组合固定化方式对最佳固定化时间及酶活性回收率的影响，并对不同方法制备的固定化酶的热稳定性、操作稳定性及结构进行了研究。3)将介孔分子筛MCM-41和SBA-15进行环氧硅烷化，制得功能化载体K/MCM-41和K/SBA-15,并利用共价结合法固定-淀粉酶。考察了吸附时间、给酶量和pH对-淀粉酶固定化性能的影响，并对固定化酶的活性、稳定性、载体结构等进行了研究和比较。2实验部分2.1实验材料2.1.1实验试剂