AFLP分子标记实验流程

1、AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性Amplifiedfragmentlengthpolymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。其基本原理是：以PC

2、R（聚合酶链式反应）为基础，结合了RFLP（限制性片段长度多态性）的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增（在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增），再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA。二、实验设备1美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，美国MJ公司PCR仪，安玛西亚电泳仪等。三、实验试剂1.试剂：请使用高质量

3、产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。DNA提取试剂盒；EcoRI酶,MseI酶，T4连接酶试剂盒；Taq酶，dNTP,PCRreactionbuffer；AFLP引物；琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水（18.2MQcn）2其他实验需要物品微量移液枪（一套）及相应尺寸Tip头,PCR管，冰浴等。四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA，通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。2、EcoRI酶消化（20ul体系/样品）37C2hrs65C30min终止反

4、应EcoR11ul(10U/ul)10XBuffer2ulsample(总DNA)5ulddH2O12ul3、Msel酶消化（20ul体系/样品）TOC o 1-5 h zMsel2ul（lU/ul）= HYPERLINK l bookmark18 o Current Document 10XBuffer2ulsample（EcoR1酶切产物）15ulC65C2hrs80C30min终止反应ddH2O1ul/4、T4DNALigase（20ul体系/样品）接头退火65度10分钟25度2小时2ul（1U/ul）2ul10ulI1ul（不稀释）22C3hrs1ul稀释10倍4ulT4DNALiga

5、se10XBuffer65C10min终止反应sample（双酶切产物）Mse1AdaptorEcoR1AdaptorddH2O5、预扩增（20ul体系/样品）TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark24 o Current Document sample4ulPrimer（Mse1/EcoR1）1ul（100uM分别稀释14倍）AFLPCoreMix15ul*AFLPCoreMix配方：ddH2O8.8ulMgCl21.6uldNTPs（2.5mM）1.6ulTaq酶（1U/ul）1ul10XBuffer2ul预扩增程序：94C2min94C20s、56C30sx

6、20cycles72C2min60C30min6、选择性扩增（20ul体系/样品）sample4ul（预扩增产物稀释20倍）Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX）1ul（M引物100uM稀释14倍，E引物100um稀释100倍）TOC o 1-5 h zAFLPCoreMix15ul选择性扩增程序：94C2min94C20s、66C30s每循环降1C,共10个循环72C2min丿94C20s*56C30s20个循环72C2min60C30min7、产物电泳检测上样液：LoadingBuffer20ul旦fflj刚ISBI4IQ曰口注灵科A耳UtZSMHSizestandard-6

7、00Sample0.2ul3ul（稀释10倍）四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter）公司CEQ8000遗传分析系统，运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离，采用激光激发荧光采集数据，灵敏度极高，电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0、1”矩阵，便于对结果进一步深入分析研究，整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成，最大程度避免了人工操作造成的误差，提高了数据的可靠性。产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1），得到的数据（图2）用第三方软件再进一步统计分析。图1AFLP分子指纹图谱fFB

8、orimW-JtiMAAaIMHFAj-?G.-AA,P-AflJJIIV&*碍3Jh班WlXlW賊呗匝叵阪lTuiDlgJLiT.snTr-nJrrsrTajli越为规H刘IDgaoJ7153ow002owqlnl3lj2l卫盗33NTIJCMIZ:KfcSS3殆:Ji1.6?3I瘀JI5J17JITiK:33i23血器M1.3&阴总ME肝:KGLIOkFIMamliM|aaaaiaQ0iaoiamant1021H|w“iUfAamowl（00a00?an?aqiamFF1F1FrmmFinnEinIDldIdIdnfiinEicnEnEiEiniiMrirlr|rjilrjalanlnln

9、lqalaI-alalnilFKFlFin17區旦脚同FFrnmrkbuITI斤nmEnnnrnFIFl冋-FllpHt-厂匚rlm-材r昭KFnKITL3黑一器黑討nrlIil-dQPT右p亍十丿7TFLHRp訂I“jjln1hi7订门|ni11nn|ajn|iDHirdnlnnlBlidrLijJLJJjJj-llnlglnlnRHIDlDlDDIDIDIDIIIIIQI门IIIIPlEEInncintir*mriKKiEinEiiEiiFiIVlVilmTEilEilEilEiiEilEllHalbI匚如F鈕IIIDt：akriFgjEp*i3tlniNsui歸止0时ILU己工SnS町F

10、itimP曰回圍詐血粉臧!抽fi脳g哙,M_厂Fi*#MiaMuVr田REYgdESf*.irhidncHIUHl叶rIIl1314如卜.為宜；|H|i9iam:|H芒单曲盘kwIwu-KMSatiK?WiwIff-芒“图2AFLP“0、1”矩阵图AFLP操作流程图：总DNAEcoRl酶切Msel酶切连接接头预扩增选择性扩增H优化电泳检测|数据分析附录1：常用的8对AFLP选择性扩增引物：E-AGG:5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E-ACG:5-GACTGCGTACCAATTCACG-3E-AAC:5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E-ACA:5-GACTGCGTA

11、CCAATTCACA-3E-AGC:5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E-ACT:5-GACTGCGTACCAATTCACT-3E-AAG:5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3E-ACC:5-GACTGCGTACCAATTCACC-3M-CAA:5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3M-CAC:5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3M-CAG:5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3M-CTA:5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3M-CAT:5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3M-CTC:5-GATGAGTCCTGAGTAACTC

12、-3M-CTG:5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3M-CTT:5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3附录2：AFLP传统垂直板电泳(银染法检测)介绍：原理与方法同前，区别：1.选择性扩增引物不带荧光标记；2电泳方法不同，采用测序胶垂直板电泳；3电泳结果采用银染法，比较直观，但条带的统计与分析全人工化，工作量大，银染法灵敏度比荧光标记法要低。示例：下图为玉米(maize)DNA的AFLP图谱。24S100_1o5PanelA:AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingEcoRIprimerE-AGGwitheightMselprimers:M-CAA(1),M-CAC(2),M-CAG(3),M-CAT(4),M-CTA