DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用

1、DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用刘派（北京科技大学化学与生物工程学院生物技术系，北京市100083）摘要：随机扩增多态DNA（randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）,是美国学者Williams和Welsh于1990年首先提出的该技术是通过分析DNA的PCR产物的多态性来推测生物体内基因排布与外在性状表现的规律的技术。RAPD技术是以8-10bp的随机寡核苷酸片段作为引物，对基因组进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或PAGE电泳检测后显色，分析扩增产物DNA片段的多态性，此即反应了基因组相应片段由于碱基发生缺失、插入、突变、重排等所引发的

2、DNA多态性。至今，该技术已广泛应用于种质资源研究，作物遗传多样性分析，基因定位，找特定基因，如抗性基因、雄性不育恢复基因等可连锁的标记和物种识别，植物系统进化研究等多个领域，本文以草坪草为实验对象进行RAPD标记技术的应用。关键词：RAPD分子标记；凝胶电泳；草坪草；随机扩增；DNA引言RAPD技术一方面继承了PCR率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点。此外，与其它DNA多态性分析方法相比。RAPD技术还表现出很多独特的优势和特点：（1）不必知道被测DNA特异性位点序列信息；（2）模扳DNA的量极少；（3）RAPD技术操作简便快速；（4）RAPD所用引物均为人工定序合成；（5）基因型

3、的检测自动化。本实验在液氮环境下提取六种植物的DNA后，用实验室编号为131-136的引物对六种DNA进行随机扩增，接下来对其进行TBE凝胶电泳实验操作，得到跑胶结果并对其进行分析。1RAPD标记原理原理RAPD技术利用一系列随机引物，以DNA为模板，通过基因放大器进行多态性DNA片段的随机合成.如果某一引物与某一片段的模板DNA具有互补的核苷酸顺序该引物就会结合到单链的模板DNA上，在具有4种游离dNTPs的情况下.通过DNA聚合酶连接.DNA链就会从引物的3OH端开始，某一引物可能会与单链DNA的许多地方结合.但只有在2000个碱基对以内.存在反向平行的某一引物互补的双链DNA分子，才可能

4、将合成的新链作为下一次合成的模板.这个反应由3个不同温度的反应步骤连续循环所组成.第一步.欲扩增DNA双链的变性.DNA双链在92941加热变成单链，快速冷却阻碍了单链DNA的重新结合.第二步，退火，随机寡核苷酸引物互补地靠在DNA模板链的目标位置上.退火温度通常在35391.对于理想的RAPD技术条件按经验必须优化.第三步.适温延伸，共进行3545次循环.扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB染色来检测扩增片段的多态性.RAPD所用的一系列引物其序列各不相同.但对于任一特定的引物.它同基因组DNA有特定的结合位点.如果这些结合位点在基因组某些区域内的分布符合PCR扩增的条件，就可

5、扩增出DNA片段.因此.如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失、或碱基突变就可能导致这些特定位点分布发生相应的变化.而使PRC产物增加、缺少或发生分子量的改变.因此通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性.由于进行RAPD分析时可用引物数量很大.虽然对每个而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的.但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组.因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测.RAPD技术的优点RAPD技术一方面继承了PRC效率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点.此外.与其它DNA多态性分析方法相比.RAPD技术还表现出很多独特的优势

6、和特点：第一，由于RAPD技术引物的设计是随机的，因此可在不知道特异性位点序列信息的情况下，对各种生物进行DNA多态性分析构建其基因指纹图谱；第二，RAPD技术需模扳DNA的量极少.每个反应仅需几十纳克DNA；第三，RAPD技术操作简便快速.可免去其它DNA标记中的克隆制备，多态性筛选，同位素标记等步骤；第四，RAPD所用引物均为人工定序合成；第五，每个RAPD标记就相当于一个序列位点，故这种方法可以使基因型的检测自动化。1.3影响RAPD的因素引物的合成是随机的，但要满足G+C的含量不低于40%，引物的长度以10bp为佳，引物太短(9bp)易从模板上脱落，聚合反应难以进行;引物的浓度通常是0

7、.2umol/L，这一浓度足以完成40个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率这两者均可竞争酶、dNTP和引物。但如引物浓度不足，则PCR的效率极低，扩增产物的产量太低。4种dNTPs在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。2实验步骤实验材料准备一.配制1MTris-HCl(pH8.0)配方:1MTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0).称量121.1gTris置于1L烧杯中。.加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。.按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。PH值浓HCI7.4约70ml7.6约60ml8.0约42m

8、l(4).将溶液定容至1L。(5).高温高压灭菌后，室温保存。二配EDTA(0.5mol/1pH8.0)配方:EDTA(0.5mol/lpH8.0)称取93.06克EDTA2Na2H2O，置于500mL烧杯中加入约400mLddH2O.用热磁力搅拌器充分搅拌用NaOH调节pH值到8，约用10克固体NaOH(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至pH=8加ddH2O将溶液定容到500ml(6)高温高压灭菌后，室温保存三.1XTEBuffer储存液分装至500mL锥形瓶中，250mL/瓶，分成4瓶。灭菌备用。配方组份浓度10mMTris-HCl，1mMEDTA(pH8.0).量取下列溶液，置于1L烧

9、杯中。1MTris-HClBuffer(pH8.0)10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL.向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。.将溶液定容至1L。.高温高压灭菌，室温保存。将三种的溶液配好后，再统一灭菌，保存。准备灭菌水(500mL蓝盖瓶装)1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5mL离心管2盒,普通1.5mL离心管2盒，普通4mL离心管2盒,PCR小指管200pl2盒，灭菌，保存。电泳缓冲液：5XTBE(贮存液/L室温保存)54gTris碱27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.5XTBE(工作液)草坪草基因组DNA的提取草坪草提前两至三周种

10、植，当草坪草的生长到了比较茂盛的阶段，即可进行基因组DNA的提取。使用天根新型植物基因组提取试剂盒(DP320)，操作步骤如下：1.处理材料：清洗研钵及研磨棒，晾干或烘干，液氮预冷。取草坪草新鲜叶子组织100mg加入液氮充分研磨。加入400pl缓冲液LP1和6plRNaseA(10mg/ml)，漩涡震荡1min，室温放置10min。加入130pl缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1min。12000rpm(13400g)离心5min,将上清移至新的离心管中。加入1.5倍体积的缓冲液LP3(使用前检查是否已加入无水乙醇)，立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步所得溶液和絮状沉淀都

11、加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（13400g）离心30s,倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入700pl漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（13400g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。注意：如果吸附柱呈现绿色，向吸附柱CB中加入500pl无水乙醇，12000rpm（13400g）离心30s,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复步骤6将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（13400g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3助于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（漂洗液中乙

12、醇的残留会影响后续的酶反应实验）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100pl洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min,12000rpm（13400g）离心2min,将溶液收集到离心管中。将同种植物的4份混合至1个离心管中，标号，封口处加贴封口膜。放入-20C冰箱中长期保存，或者直接进行下一步电泳鉴定。草坪草基因组DNA提取情况的电泳验证对于已经提取完毕的基因组DNA,需要对其进行TBE凝胶电泳实验来验证提取情况。在电泳实验之前需要制作TBE胶板，每100ml的药品用量如下：0.7gRegularAgarose,100ml0.5XTBE电泳缓冲液，7p1GoldView

13、。如需其他用量则按比例添加。称取适量的RegularAgarose至锥形瓶中，加入0.5XTBE电泳缓冲液，在微波炉中加热使之溶解。待稍冷却后加入适量GoldView,摇匀。将溶液趁热倒入已经组装好的制胶槽中，待胶板彻底冷却后方可使用。将胶板放入电泳槽中，加入0.5XTBE电泳缓冲液直至没过胶板。将草坪草基因组DNA提取液10pl到离心管中并与1plLoadingBuffer充分混合后逐个加入到胶板的泳道槽中。在第一个泳道槽内加入规格为入DNA/Hindlll的DNAMarker5pl。最后一个泳道槽内加入规格为入DNA/HindIII的DNAMarker10pl。将电泳槽正负极与电泳仪正负极

14、正确相连，注意电泳方向从负极到正极。设定恒定电压为110V,电泳1h。取出已经电泳完毕的TBE凝胶放入凝胶成像仪（118室）拍摄图像，记录电泳结果。2.4基因组DNA的定量为方便下一步的RAPD-PCR时的加入的样品剂量符合要求，需要将DNA浓度稀释到约100ng/pl,根据TBE凝胶电泳的条带明暗程度确定相应稀释倍数。2.5草坪草DNA的RAPD扩增RAPD引物的稀释将RAPD引物稀释至10pM/pl。即从100pM储备液中吸取20pl引物溶液，分别加入180pl的超纯水，并且标号作为反应用引物。RAPD-PCR反应混合物的制备将以下溶液逐一加入灭过菌的规格为200pl的PCR专用管中，标号

15、。草坪草基因组DNA（20ng-100ng/pl）1plRAPD引物（10pM/pl）1pl2*PCRMix12.5gl超纯水10.5pl总体积25plRAPD-PCR程序94C反应3min后开始如下循环：94C变性反应1min36C退火反应1min72C延伸反应2min经过以上循环45个以后，最后一个循环72C增加5min,循环结束后，反应产物置于4C保存，如需长期保存则要放入-20C冰箱中保存。对PCR产物进行TBE凝胶电泳：制胶：同前，注意胶浓度：1.5%琼脂糖凝胶加样量：第一个泳道槽内加入规格为D2000的DNAMarker10pl,其他每个泳道槽加入10pl反应产物+1plloadi

16、ngbuffer电泳：设定恒定电压为110V,电泳时间40min左右。取出已经电泳完毕的TBE凝胶放入凝胶成像仪（118室）拍摄图像，记录电泳结果。3实验结果及分析植物总DNA的提取草坪草提取DNA电泳图D2000-zwobpDP一750bp一5*30bp一250bp-100bp（从左到右依次为：DNAmarker，黑麦草，小麦，将军菊苣，荆车草，白三叶，杂三叶，后面的泳道重复前述顺序）抵莪长10cm.电压&v/cm.0.5TEE本人提取的植物DNA为白三叶DNA,位于第六道和第十三道，从电泳结果来看，DNA提取浓度markD2000电泳图入DNA/HindIIIbpng/gg23130*47

17、7941619455571154361*SO23224820274256411采用131-136六种引物在PCR仪进行扩增，得到如下凝胶电泳图：较高，经过估计，稀释七倍后用于后续多态性PCR扩增处理。6pl加样，凝胶长度10cm,电压6v/cm,0.5XTBEBuffer标准DNAmarker片段电泳结果植物DNA的多态性扩增markD2000D电泳图如下：从左到右看，第1，8，15道为markerD2000，本人所提白三叶DNA位于第6，13道。在引物为131的情况下，白三叶DNA在第6道跑胶，随机扩增效果较好，可以看到六个条带，从上往下看，第一个和第二个条带颜色较浅，含量较少，其中第一个条

18、带为500-750bp之间，第二个条带在500bp左右；第三个和第四个条带比前两个条带亮，但是不及后两个条带亮，含量介于两者之间，其中三号条带略低于250bp，四号条带位于100-250bp之间；第五号和第六号条带很亮，扩增最多，其中，第五号条带略高于100bp，第六号条带低于100bp。总而言之，引物131比较适合白三叶植物的RAPD。在引物为132的情况下，白三叶DNA在第13道跑胶，随机扩增效果过强，条带很亮，可以看到三个明显条带，但是其余条带未明显分离。从上往下看，第一个条带为500bp左右，第二个条带在250bp左右；接下来，从250bp到低于100bp，均有条带出现，但是基本上是连续的，未有明显分离。其中在150bp左右出现最大亮度，明显高于周围，说明此条带扩增最多。总而言之，引物132作为引物时，扩增量大，但是分离不明显，故不太适合白三叶植物的RAPD。参考文献：西学院学报.1RAPD标记技术及其应用进展白生文.2008.河2生物实验室系列DNA分子标记技术在植物研究中的应用.周延清2005.北京化学工业出版社P79-130上面一排，从左到右看，第1,8,15道为markerD2000,本人所提白三叶DNA位于第6,13