western blotting(蛋白免疫印迹)

1、 蛋白质免疫印迹技术详解主要内容、WesternBlot简介二、WesternBlot一般流程1、WesternBlot成缽统、WesternBlot常见问题分析、WesternBlot基本原理 BlockingagonrMrrtoraeSet&ftdtiyaniibodyinzymff|ProductPrimaryoriibod/Prctetrti、WesternBlot应用、WesternBlot优点 高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5吗中等大小的靶蛋白1.目的蛋白的表达特性分析2目的蛋白与其它蛋白、RNA的互作兴裂解液蛋白样品的制备二、WesternBlot般流程 蛋白样品

2、的制备一SDS-PA3E电泳一转膜（PVK或C膜）一封闭一一抗一洗涤一酶标二抗反应一洗涤一显影产品名称Western及IP细胞裂解液RIPA裂解液（强）RIPA裂解液（中）RIPA裂解液（弱）NP-40裂解液SDS裂解液有效裂解成分1%TritonX-1001%TritonX-100,1%dcoxycholaic,0.1%SDS1%NP-4O：0.5%dcoxycholatc,0SDS1%NP-40,0.25%deoxycholate1%NP-4O1%SDS裂解强度温和强中温和温和强刈膜蛋白的提取一般很好较好-般一般很好刘胞浆蛋口的提取很好很好很好很好很好很好对核蛋门的捉取较好很好较好较好较好

3、很好胞浆磷酸化蛋白提取很好很好很好很好很好很好细胞核转录閃了提取很好很好很好很好很好很好含蚩白酶抑制剂是是是是是是含磷酸酣悔抑制剂是是是是是是主耍用途WB,IP.co-IPWB,IPWB,IPWB,IRco-IPWB,IP,coIPWB,CHIP5:7B2由L6WIllllol/LTris-HCl(pH6.8at25C),2%SDS,10%Glycerol(K50mmol/LDTT（二硫苏糖醇）；漠酚蓝在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性! 蛋白样品的制备那4躺虽的阴离耘面?5,它可内砒刊可的氢键,破坏蛋白质强还原剂蔬基乙醇(或二硫苏糖醇，DTT)可以断开二硫键

4、，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。(3)蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量,而与其形状及所带电荷的性质无关。AFTERSDS蛋白质-SDS胶束的特点:站卿亚1005賜和PH处齡叮州謙鮒业科具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒；平均lg蛋白质结合1.4gSDS短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的；(4)长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比;蛋白样品的定量Bradford法：考马斯亮蓝G250有红.蓝两种不同颜色的形式,在一定浓度的乙醇和酸性条件下,可配成淡红色的溶液,与蛋白结合后形成蓝

5、色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比O双缩腺法:Cu2+与蛋白质的肽键,以及酪氨酸残基络合,形成紫蓝色络合物,此物在540nin波长处有最大吸收Lowly法：第_步就是双缩腺反应,即Cu2+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷铝磷磷磚酸试剂（福林酚试剂）,结果得到深蓝色物。聚丙烯酰胺凝胶电泳1.不连续的电泳缓冲体系。2.SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。OSamplesare&Electrical&MoleculesareioadedIntocurrentisseparat

6、edbywellsappliedsize不连续电泳系统作用浓缩胶使蛋白样品浓缩分离胶使蛋白样品分离缓冲液PH凝胶浓度pH6.8Tris-Cl低，2-5%pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小Stackinggel(5%)PM=6.8Separationgel(5%)PM=8.8电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸系统PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel,简称PAG):单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)催化剂过硫酸鞍三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有一定的机

7、械强度和透明度，是良好的电泳介质，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE)o凝胶浓度与蛋白分离范围灌制分离胶用禰管将凝胶溶液抑入擬胶模具 隔绝空气ddH2O乙醇分岚胶聚合之蔚灌制浓缩胶将堆臧谱液用艙加入；O横具 插入梳子堆积胶聚合之丽 上样StakinggelSeparatinggel蛋白根掲分子盘大小分弼包泳进程可以枫捱也汨捋示拥来确定.算其跑劉底鶴上面匕n左右耶可冷止电泳小分子it蛋白跑的比较快t电泳蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动Anode-瞬加入到二样孔中处榕中塡冲液井有正电荷.与凝脱

8、底时接烛Cathode+转膜半干法将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸之间,电转10-30mino湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中,电转4h或过夜。膜的选择1.PVDF膜(polyvinylidenefluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。2.PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的蛋白选用0.2um的膜。3.预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电的蛋白结合。湿转系统l-JCattide/MAnodeSMhcI

9、slGirHssmpndFilterpaperGelMembnanEFilteroperfoampad23 不同大小蛋白的转膜条件:转膜蛋白x(kDa)转膜液转膜条件x20甘氨酸(0.2M),3.0gTris碱(25mM),200ml甲醇(20%,pH8.5),用水定容至。20 x120配方同上120 x200甘氨酸(0.2M),3.0gTris碱(25mM),200ml甲醇(20%,pH8.5),0.05%SDS,用水定容至。200 x配方同上250mA恒流转3hrs250mA恒流4hrs250mA恒流转6hrs500mA恒流转4hrs 半干转移系统封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜

10、发生非特异性结合而使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。脱脂奶粉(5%)、BSA(1%)一抗、二抗孵育1.加入一抗溶液与滤膜温育，37C2小时或4C过夜。2.回收一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次5mino3加入用TBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动,室温孵育1-2小时。4.倒掉二抗溶液,用TBST漂洗液滤膜3次,5min,最后一次用TBS。二抗与底物反应显色化学发光显色法(HRP)ECL中的1uminol被HRP和禺。?氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强影响发光的因素主要有：含HRP的抗体；发光试剂；反应的杂质；2洗脱抗体一抗洗脱二抗洗脱一抗种属来源不同时,str

11、ip二抗即可 三、显色暗室曝光Tanon5200全自动化学发光图像分析系统Tanon5200-适用于高分辨率和高灵敏度的图像拍摄；可设定连续采样的次数、起始及终止曝光时间，进行动态连续拍摄，拍摄得高质量的图片； -性能特点cam扫審适射光聂3&M.1P1.16|口19累加闽先时间FFF；10.250s.I*I:起P自至卩厂潮览 Tanon5200一-软件特点具有序列图像保存功能，无需单张图片分别存储；具有分析软件，可进行泳道密度扫描、半定量计算,分子量计算；图像叠加分析功能：可对两个图像进行合并显示，并进行分析；四、SDS常见问题 胶不平？凝胶漏液?胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲凝胶肿胀或卷曲?条带歪斜或漂移?单个或多个白点?转膜缓冲液过热？液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海