总提取以及免疫组化

1、关于总提取及免疫组化第一张，PPT共四十九页，创作于2022年6月一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt第二张，PPT共四十九页，创作于2022年6月二、RNA提取的注意事项 RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是

2、新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。 RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。第三张，PPT共四十九页，创作于2022年6月1) 样品处理： （）培养细胞：收获细胞 1-510 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 10min 。 （）组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置10 min 。三、RNA提取的

3、实验操作 第四张，PPT共四十九页，创作于2022年6月2)加入200 l氯仿， 震荡混匀20-30s，室温放置5min（此期间液体开始分层，此时不要轻易搅动液体）。3)10000 rpm，离心5min。RNA (清澈透明)DNAProtein4) 将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。三、RNA提取的实验操作 第五张，PPT共四十九页，创作于2022年6月5) 沉淀RNA： 加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。 10000rpm，离心10min。弃上清。6) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)7) 7500rpm离心1mi

4、n，弃上清。 再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。第六张，PPT共四十九页，创作于2022年6月8)室温干燥35min。 （干燥的时间由RNA沉淀大小决定） （干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项：RNA:避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。RNA pe

5、llet：透明胶样干燥后应该无色透明第七张，PPT共四十九页，创作于2022年6月9） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 20-30l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。10) 吸出 2-3 l溶液放到冰上备用(将用于电泳)。11) 剩余溶液放到冰上备用 （将用于RTPCR）。注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。避免气泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。第八张，PPT共四十九页，创作于2022年6月 将 RNA

6、 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳 9 l RNA 样品 23 l 上样液轻轻混匀， 上样 电泳: 120伏，1020分钟 注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果第九张，PPT共四十九页，创作于2022年6月RNA电泳结果 rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。第十张，PPT共四十九页，创作于2022年6月RNA纯度的判断 280、230、260nm下的吸

7、光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物的值 A260/A280 1.82.0 1.8表明有蛋白质、苯酚的污染 2.2表明RNA已经水解成单核酸 A260/A230 2.0 2.0表明酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物污染第十一张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化的原理及流程介绍2015-07-21第十二张，PPT共四十九页，创作于2022年6月主要内容免疫组化原理及流程介绍一.免疫组化的原理二.免疫组化的基本流程三.免疫组化的结果分析第十三张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化的原理 应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的

8、技术。免疫组化原理及流程介绍第十四张，PPT共四十九页，创作于2022年6月直接法Tissue AntigenLabeled Antibody将荧光、酶直接标记在一抗上优点：简单方便缺点：灵敏度低每种一抗都需要进行标记 免疫组化原理及流程介绍直接法第十五张，PPT共四十九页，创作于2022年6月间接法Tissue AntigenPrimary AntibodySecondary Antibody将荧光、酶等标记在二抗上优点：灵敏度高只需要少数标记的二抗可以和相应的一抗反应 免疫组化原理及流程介绍间接法第十六张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化SP法SP法-链霉素抗生物素蛋白-过氧

9、化物酶法 （streptavidin-peroxidase）一抗生物素标记的二抗Streptavidin-HRP（HRP标记的链霉亲和素）简化实验步骤减少非特异性背景免疫组化原理及流程介绍免疫组化SP法第十七张，PPT共四十九页，创作于2022年6月 ABC法 (Avidin Biotin-peroxidase Complex)一抗生物素标记的二抗Avidin-Biotin-HRP Complex（亲和素-HRP标记的生物素）亲和素与HRP标记的生物素混合，放置30分钟。一个亲和素分子具有可与生物素结合的四个部位。大大增加了结合到生物素上的过氧化物酶，提高了显色反应的 灵敏度。免疫组化ABC法

10、免疫组化原理及流程介绍免疫组化ABC法第十八张，PPT共四十九页，创作于2022年6月三 免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.抗原修复、暴露抗原决定簇 4.封闭非特异性蛋白 5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反应 8.显色 9.复染、脱水、透明、封片 2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 第十九张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化 脱蜡与水化的目的是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。第二十张，PPT共四十九

11、页，创作于2022年6月60 20 minXylene：2 10 minutes； 100% absolute ethanol： 2 5 minutes；95% ethanol 2 minutes； 80% ethanol 2 minutes； 70% ethanol 2 minutes；distilled water:5 min；PBS 洗 3 3 min。 具体操作第二十一张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。(1)细胞通透第二十二张，P

12、PT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍(2)封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。 第二十三张，PPT共四十九页，创作于2022年6月1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30H2O2。2)PBS 溶液洗 3 次3 min。 免疫组化原理及流程介绍具体操作:第二十四张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程

13、介绍3. 抗原修复 暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。 第二十五张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。 抗原修复的主要方法:酶消化方法一般用于细胞内抗原应用高频电磁波打开蛋白质间的交联键第二十六张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷

14、却至室温，再加热，约4次，每次间隔补足液体，防止干片。2)PBS 溶液洗 3 次3 min。具体操作（微波修复）：1)第二十七张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍4.封闭特异性蛋白组织切片上有些剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。 第二十八张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 (约30)下1030m

15、in。 具体操作：大一点第二十九张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍5.一抗孵育一抗:可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。 第三十张，PPT共四十九页，创作于2022年6月 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。 免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；2.使抗原抗体结合更稳定。第三十一张，PPT共四十九页，创作于2022

16、年6月 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 复温 45 min。 免疫组化原理及流程介绍具体做法：第三十二张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍6.二抗孵育二抗:可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。第三十三张，PPT共四十九页，创作于2022年6月 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去

17、摸索一抗浓度和孵育时间。 免疫组化原理及流程介绍第三十四张，PPT共四十九页，创作于2022年6月 1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min5 次； 2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 37恒温烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次5 min 免疫组化原理及流程介绍具体操作：第三十五张，PPT共四十九页，创作于2022年6月7.SP反应 SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO基。第三十六张，PPT共四十九页，创作于2022年6月 免疫组化原理及流程介绍1） 加入

18、SP 复合液后放入 37 度烤箱中 30 min。 2） 用 PBS 洗 5 次5 min。具体操作：SP染色法的特点: 灵敏特异性低，成本低。第三十七张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍8.显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察。第三十八张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（HRP）法中，显色剂为DAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液)配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-

19、40ulABC 法SP法PAP法第三十九张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍9、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。 片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。第四十张，PPT共四十九页，创作于2022年6月1) 用 PBS 3 次3min 后，用双蒸水洗 5 min；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染 20 s ），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。 2) 脱水：50% ethanol (1-

20、2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。3) 透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 4) 封片：中性树胶。 免疫组化原理及流程介绍第四十一张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍四 免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。第四十二张，PPT共四十九页，创作于2022年6月免疫组化原理及流程介绍1阳性染色特点 Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色 细胞与组织无区别） 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）。须从以下几个方面综合评价：第四十三张，PPT共四十九页，创作于2022年6月 2组织切片制作过程的影响