《基因组学》课件第7章 PCR技术及其相关技术的发展和应用-2015

1、1第7章PCR技术及其发展和应用郑州大学生命科学学院马珊珊目录PCR技术简介PCR技术的衍生技术实时荧光PCR技术PCR技术的应用3一、PCR技术简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。它是在体外条件下，利用DNA聚合酶通过多次循环的合成反应催化一端特异DNA片段的合成。1.PCR的基本原理和步骤 The Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodMullis F

2、4一、PCR技术简介1.PCR的基本原理和步骤（1）变性（denaturation）：模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。（2）退火（annealing）：温度下降，变性DNA复性，使寡核苷酸引物即与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。（3）延伸（extension）： 在适宜条件下（包括DNA聚合酶和核苷酸单体），引物3 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。PCR类似于体内DNA复制过程。变性、退火和延伸。PCR Cycle Step1变性（95 ）Target SequenceTarget Sequence模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，

3、使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCR Cycle Step2退火（低温 ）Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模

4、板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA互补的链。PCR Cycle Step3延伸（72 ）End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget SequenceTarget AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target121=2222=4323=8424=16525=326 26=6420 220302301 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cy

5、cle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon10一、PCR技术简介2.PCR反应标准的PCR反应条件：10X缓冲液 10 L4种dNTP混合物 各200umol/LTaq DNA聚合酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12g水 补足体积2Mix11一、PCR技术简介2.PCR反应12一、PCR技术简介2.PCR反应131234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火

6、2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95一、PCR技术简介2.PCR反应14PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物15PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶16PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始17PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq18PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2

7、轮结束19PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 20 PCR产物的积累规律示意图21灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA一、PCR技术简介2.1 PCR反应的特点CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物2

8、0.50.510 PCR Buffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH O216.315.3Total2020（1）在0.2 ml PCR管内配置20ul反应体系：一、PCR技术简介2.2 PCR反应的实验步骤（2）PCR反应程序(1) 94变性5min，(2) 94变性1min，(3) 52 退火1min，(4) 72 延伸1min。(5) 72 延伸10min。(6) 4 保存。重复(2)-(4)30次一、PCR技术简介2.2 PCR反应的实验步骤PCR结果：1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）（3）PCR产物的电泳鉴定一、PCR技术简介2.2 PCR反应

9、的实验步骤Lambda DNA，模板量分别为100 pg, 10pg, 1pg, 100fg , 10fg25一、PCR技术简介3. PCR的影响因素3.1 DNA模板单、双链DNA均可，多种来源。质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般人基因组100 ng DNA模板（100L）。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。26一、PCR技术简介3.2 引物27一、PCR技术简介3.2 引物引物设计的原则：引物长度在1530碱基。引物中碱基的分布是随机的，G+C含量宜在4555左右。引物内部避免形成发夹结构；引物间避免形成二聚体。引物3端为关键碱基；5端无

10、严格限制引物的特异性，避免在模板内存在较高的相似性序列。28一、PCR技术简介3.2 引物引物设计的常用软件：Primer Premier 5.0Oligo 6primer 5The Primer GeneratorNet Primer1. 将序列输入软件中（2）在表中粘贴序列（1）新序列两个方法选择序列文件所在位置（2）打开原有的序列文件在对话框中输入待扩增序列点击左上角的“Primer”按钮2. 设置相关参数3. 得到的引物结果Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对Cross

11、 Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体正向和反向引物的评价正向和反向引物的信息每点击左边红色的按钮，就出现相应的内容对正向和反向引物进行编辑正向和反向引物的互换可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入5个碱基引物的信息改动后引物的信息重新回到双引物的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 34. 输出引物序列39一、PCR技术简介3.3 耐热DNA聚合酶1）Taq DNA聚合酶（Taq polymerase） ：95的半衰期为40min，最适温度（72）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸。酶活性（受多

12、种因素影响）：53方向的聚合酶活性，53方向的外切酶活性和逆转录酶活性，非模板依赖性活性，使PCR产物的3端突出一个单A核苷酸尾40Tth DNA聚合酶：用于一步法RT-PCR。Vent DNA聚合酶：其保真性较Taq DNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（12kb）的功能较强。Pfu DNA聚合酶：其保真性比Taq聚合酶高12倍，是已知的保真性最高的聚合酶。但不适于2kb的片断扩增。2）其他的耐热聚合酶一、PCR技术简介3.3 耐热DNA聚合酶41一、PCR技术简介3.4 dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度，四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量，终

13、浓度一般在100-200uM。 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。42一、PCR技术简介3.5 Mg2+浓度 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。43一、PCR技术简介3.6 反应参数（1）变性：90-95 ，30-60s（2）退火：温度由引物长度和GC含量决定。一般30s即可。（3）延伸：一般72 ，延伸时间由扩增片段长度决定，

14、一般1kb/min.（4）循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次。44一、PCR技术简介4. PCR产物的检测琼脂糖凝胶电泳：最常用的方法。分辨率高，可测出1ng DNA。聚丙烯酰胺凝胶电泳：灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高，主要用于分离小于1kb的片段，因此特别适用于合成的片段的分离和检测。层析技术：广泛应用于DNA的合成及其扩增后的分离纯化。分子杂交：包括点杂交和Southern印迹杂交。45二、PCR技术的衍生技术逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）反向PCR（inverse PCR）巢氏PCR（nesting PCR）原位PCR（i

15、n situ PCR）突变PCR（mutation PCR）多重等位基因PCR（multiplex allele PCR）不对称PCR（asymmertric PCR）实时定量PCR（real time PCR）二、PCR技术的衍生技术47二、PCR技术的衍生技术1.逆转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR) RT-PCR是扩增RNA的PCR反应，包括两个步骤：在单引物的介导下以RNA为模板利用逆转录酶催化合成RNA的互补链cDNA，即逆转录。以cDNA为模板，在特异性引物引导下，扩增合成靶DNA分子，即普通PCR。48二、PCR技术的衍生技术1.逆转录

16、PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)49二、PCR技术的衍生技术1.逆转录PCR的应用测定基因表达的强度鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5和3末端序列，从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。50二、PCR技术的衍生技术1.逆转录PCR的影响因素（1）模板对RT-PCR的影响对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格。RNA分子必需完整，其次RNA样品中不能含有DNA、蛋白质等杂质。（2）逆转录酶对RT-PCR的影响MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定 性较AMV逆转录酶差。51（3）逆转录引物

17、对RT-PCR的影响 随机引物：原核细胞多用， 6-10bp，含有四种碱基的任意组合，可在RNA多个位点与之结合，引导合成长短不一的cDNA。 oligo(dT)：真核细胞多用， 12-18bp的oligo(dT)与真核生物的mRNA的polyA尾巴特异结合，引导全长mRNA的合成。基因特异性的引物(GSP)：特异性强，广谱性低， GSP一次只针对一个基因，不适合多基因检测或表达差异比较的研究。二、PCR技术的衍生技术1.逆转录PCR的影响因素52二、PCR技术的衍生技术1.逆转录PCR-举例RNA提取RT-PCR电泳分析53二、PCR技术的衍生技术2.反向PCR（inverse PCR） 用

18、反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。已知序列未知序列未知序列54已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶二、PCR技术的衍生技术2.反向PCR（inverse PCR）55探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆-RACE；建立基因组步移文库-Gene Walking。56二、PCR技术的衍生技术2.反向PCR（inverse PCR）应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因57二、PCR技术的衍生技术3.巢式PCR（Nest PCR）

19、巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。5859巢式PCR的优点：特异性高。如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。 由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污

20、染。60二、PCR技术的衍生技术4.突变PCR 突变是改变DNA序列的最基本的方法，用以鉴定一个基因或DNA片段的功能，研究蛋白质结构-功能关系。主要分为： 随机突变：在目的基因的任意位点引入点突变，建立突变文库。 定点突变：在选定的位点对DNA序列进行修改，主要通过引物点突变、碱基或小片段的插入或删除。61（1）随机突变：应用：构建突变体文库，继而可从中筛选出具有特殊性质的突变个体策略：易错PCR（error-prone PCR）。利用Taq DNA聚合酶等耐热DNA聚合酶不具有35校对功能的特性，在PCR扩增反应中可能掺入错误的核苷酸，从而产生随机错误的扩增产物。二、PCR技术的衍生技术4

21、.突变PCR62（2）定点突变A. 5端引入突变：通过修饰上游引物的5端，即可引入标记的碱基、限制性酶切位点、启动子序列等。B. 序列中的单位点突变：采用重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE PCR)二、PCR技术的衍生技术4.突变PCR63（A）为5端引入突变 （B）为单碱基突变二、PCR技术的衍生技术（B）Site-directed Mutagenesis (Kit)65大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，来自大肠杆菌的质粒99发生甲基化；PCR产物是去甲基化的产物；DpnI识别甲基化位点并切割DNA，而去甲基化扩增产物不会被降解；经过转化，

22、PCR产物链经过修复形成环状，从而完成突变 66（3）多位点突变策略：多次重叠PCR关键：重叠引物的设计（每对突变引物需要部分重叠，方向相反）。二、PCR技术的衍生技术67二、PCR技术的衍生技术5.原位PCR（in situ PCR）原位PCR是由Hasse等于1990年首创。 它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段。 在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。68操作步骤：1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后

23、便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2. 原位PCR扩增细胞内目的片段3. 原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达二、PCR技术的衍生技术69 实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。三、实时荧光PCR技术 荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过软件对PCR反应中起始模板进行定量及定性的分析。 系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。 三、实时荧光PCR技术1.实时定量PCR

24、技术原理71 PCR扩增时，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。三、实时荧光PCR技术1.实时定量PCR技术原理72三、实时荧光PCR技术2. 常用荧光标记试剂和方法非特异性荧光染料标记 SYBR Green I特异性荧光探针标记 TaqMan Probe73三、实时荧光PCR技术2.1 荧光染料 SYBR Green I是目前定量PCR最常用的一种荧光染料。SYBR Green I是一种结合于所有双链DNA双螺旋小沟中具有绿色激发波长的染料。

25、与双链DNA结合后，其荧光大大增强，荧光强度与双链DNA分子的数量有关，因此可根据荧光信号检测出PCR反应体系中双链DNA分子的数量。SYBR Green I74热 变 性引物退火延伸反应三、实时荧光PCR技术2.1 荧光染料-作用机理75 使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势优 点 无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低缺 点三、实时荧光PCR技术2.1 荧光染料-优缺点76三、实时荧光PCR技术2.2 荧光探针（1）Taqman探针原理 5端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) 探

26、针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光;R与Q分开，发荧光 Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针77热变性引物和探针与模板退火延伸反应探针报告基团淬灭基团探针DNA聚合酶引物RRRR三、实时荧光PCR技术（1）Taqman探针工作机理78 高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针缺 点三、实时荧光PCR技术（1）Taqman探针优缺点79三、实时荧光PCR技术2.2 荧光探针（2）其他探针 分子信标 双杂交探针 蝎型探针 自身淬灭荧光探针80三、实时荧光PCR技术3.实时定量PCR常用的三个概念 扩增曲线

27、 荧光阈值 Ct值荧光基团三、实时荧光PCR技术A、扩增曲线扩增曲线的两种形式.左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。Cycle（循环数）Rn（荧光强度）基底期指数期平台期三、实时荧光PCR技术A、扩增曲线83在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。三、实时荧光PCR技术B、阈值线84 PC

28、R扩增过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所对应的扩增循环数。三、实时荧光PCR技术C、Ct值85横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值极具重现性三、实时荧光PCR技术Ct值的重现性86Ct值与初始模板含量 Ct值与初始模板浓度的对数值成线性关系 初始模板量越多，C(t)值越小10610510410310210三、实时荧光PCR技术87定量原理初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）；利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，只要获得位置样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起

29、始拷贝数（模板量）。确定初始模板的浓度三、实时荧光PCR技术三、实时荧光PCR技术4.绝对定量与相对定量的比较89绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。绝对定量通过标准品定量902. 绝对定量标准品的标准必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）标准品必须是标准化的（例如，同一化

30、的细胞数）在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值标准样品的种类： 含有目的基因的线性化的质粒DNA 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA PCR的产物 913. 标准品的制备根据已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。绝对定量：从荧光到拷贝数934. 实例标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55108copy /ul。标准曲线的绘制（1cycle=1min）设置对照：浓度为1.55107、1.55106、1.55105、1.55104、1.55103、1.55102、1.55101的标准样品各一个，设空白对照PCR反应：