紫外可见分光光度法分析化学讲义课件

1、第11章 紫外-可见分光光度法Ultraviolet and Visible Spectrophotometry可见光的色散与互补/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿白光由一系列不同颜色（波长）的光组成。两种适当颜色（波长）的光按一定强度比例混合可获得白光。物体的颜色是如何产生的？物体所呈现出的是不同结构的物质对白光选择性吸收后透过（透明物体）或反射（不透明物体）的互补光的颜色。物质结构决定可吸收波长及能力定性及结构分析基础物质含量决定颜色

2、的深浅定量基础基于物质对光的选择性吸收现象即可建立起相应的分析测定的方法：如UV-Vis光谱法、IR等。紫外-可见分光光度法（UV-Vis）分子光谱方法，利用的是分子对外来辐射的吸收特性；涉及分子外层电子的能级跃迁；光谱区在200800 nm；UV-Vis主要用于分子的定量分析，亦可作为化合物（尤其是有机化合物）定性鉴定的辅助手段（有机四大波谱之一）；还可用来研究物质间相互作用（结合比、结合常数的测定等）；是高效液相色谱法（HPLC）的常规检测器（80%的有机化合物具有UV吸收）。11-1 紫外-可见吸收光谱概述（1）UV-Vis光谱的形成（本章以透射光谱为主）运动分子的外层电子吸收某波长的外

3、来辐射产生电子能级跃迁外来辐射的强度减小分子吸收光谱。记录吸光度A随波长变化的曲线即得到相应紫外可见吸收光谱。激发态分子不稳定，当其返回基态时能量如何释放？光源单色器样品分子检测器读出装置激发态分子典型的UV-Vis光谱图末端吸收最强峰肩峰峰谷次强峰11-1 紫外-可见吸收光谱概述（2）定量分析基础420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 6401.00.50标准曲线标准加入样品池任意波长下，吸光度A与待测试样浓度c均存在正比关系，应该如何选择测定波长？11-1 紫外-可见吸收光谱概述（3）定性/结构分析基础Uv-Vis的吸收峰数目、位置及强度、谱

4、带形状与物质分子内部结构密切相关，可用物质的定性及结构分析。但Uv-Vis谱图简单，特征性不强，多为辅助手段UV-Vis光谱与官能团之间的关系（a）胆甾醇（b）异丫丙基丙酮UV-Vis所反映的是官能团的信息11-2 基本原理11-2-1 带状光谱的成因（自学）11-2-2 有机化合物的紫外可见光谱11-2-3 无机化合物的紫外可见光谱（自学）11-2-4 常用术语11-2-5 影响紫外可见光谱的因素11-2-1 带状光谱的成因（1）UV-Vis分子光谱呈现出较宽的谱线轮廓？分子内部存在三种量子化能级：电子能级Ee，振动能级Ev，转动能级Er，其能量可表示为：e, v, r分别为电子能级、振动能

5、级和转动能级的量子数，其数值取0（基态），1（第一激发态），n（正整数）11-2-1 带状光谱的成因（2）分子内部各量子化间隔如下：Ee最大：1-20 eV Ev次之：0.05-1 eVEr最小：0.05 eV外层电子处于基态的分子，其振动、转动能级可能处于各种状态：外层电子处于第一激发态的分子，其振动、转动能级亦可能处于各种状态：只要入射光的能量等于： 即可被分子吸收，并发生电子能级的跃迁。11-2-1 带状光谱的成因（3）固定值可变值可见：能够被分子吸收并引起外层电子跃迁的并不是单一波长的辐射，而是一系列能量差为Er的辐射，对应得将产生间隔很近（对应UV区约0.2 nm）的一系列吸收谱线，

6、其中心波长max所对应的能量由Ee决定。此外：溶液中相邻分子间的碰撞导致分子各种能级的细微变化，也会引起谱带的进一步加宽和汇合，从而使得分子光谱通常呈现为一定宽度的带状光谱。11-2-2 有机化和物的UV-Vis光谱（2）有机化合物的UV-Vis光谱取决于分子结构及其价电子的性质，其特征性可用max和max表示。价电子类型（以HCHO为例）成键轨道： 、 反键轨道： *、*非键轨道 ： n11-2-2 有机化和物的UV-Vis光谱（2）各轨道能级高低顺序： n * * * * *n * * n *非键轨道成键轨道反键轨道 (nm)禁阻跃迁且能量间隔较高（远紫外区），通常不考虑 不含共轭体系的分

7、子（1）饱和碳氢化合物仅能发生能级差很大的跃迁，吸收波长属远紫外区，如CH4和CH3-CH3的max分别为125和135 nm。含饱和杂原子的化合物还能发生n跃迁，但能级差也较大，除溴化物、碘化物、胺、硫醚、硫醇、二硫化物（R-S-S-R）在近紫外区有弱吸收外，大部分该类化合物在近紫外区无明显吸收。远紫外区属于真空紫外区，常规UV-Vis光度计无法测定（即使能测定无法提供可用信息），因此饱和有机化合物不能用UV光谱法进行分析，但常作为溶剂使用。不含共轭体系的分子（2）含非共轭烯、炔基团的化合物含电子，可发生*跃迁，能级差较跃迁小，但也处在远紫外区，如乙烯和乙炔的max分别为165和173 nm

8、，如无助色团作用，在近紫外区仍无吸收。含不饱和杂原子的化合物（C=O、C=N、N=N等）这类化合物4种跃迁均可发生，但仅n*跃迁的吸收波长处在近紫外区。虽然强度较低（禁阻跃迁），但在紫外鉴定中仍不容忽视。n*跃迁通常被称为R带。不含共轭体系的分子（3）化合物max/nm化合物max/nmCH3OH183150CH3COOH20441CH3Cl173200CH3CONH221460CH3Br204200CH3NNCH33395CH2=CH217514000CH3NO228022CH CH1736000CH3COCH328016 含共轭体系的分子化合物共轭双键数max/nm（）颜色乙烯1185/1

9、0000无色丁二烯2217/21000无色1,3,5-己三烯3258/35000无色癸五烯5335/118000淡黄二氢-胡萝卜素8415/21000橙黄番茄红素11470/185000红随着共轭体系的延长，*跃迁的吸收带将明显向长波长移动（通常称为K带），吸收强度也随之增强（10000）共轭的醛、酮、酸、酯、腈、酰胺等化合物同上芳香族化合物E1带E2带B带苯在异辛烷中UV-Vis光谱E1带E2带B带180 nm204 nm255 nm6.0 x1048.0 x1032.0 x102气态或非极性溶剂中，苯及其同系物的B带有许多精细结构，这是由于振动跃迁在基态电子跃迁上的叠加。可用于鉴别芳香族化

10、合物。芳杂环（呋喃、吡咯、噻吩、吡啶）等的UV-Vis与苯环有一定类似11-2-3 无机化和物的UV-Vis光谱（1）电荷转移吸收光谱：分子同时具有电子给体部分和电子受体，能强烈吸收外来的UV或Vis光，使电子从给体向受体相应轨道上跃迁。 （分子内氧化还原）hvDADA-D: e给予体A: e接受体许多无机配合物能产生这种光谱。有机化合物或配合物亦可能产生该光谱电荷转移吸收光谱的强度大（104）且谱带宽，适于定量分析。11-2-3 无机化和物的UV-Vis光谱（2）配位体场跃迁（dd*, ff*）能级差小（可见区）；吸收弱：100较少用于定量分析，但可用于配合物结构及键合理论方面的研究。11-

11、2-4 UV-Vis中常用术语（1）生色团含非键或键电子，能吸收外来辐射引发n-* 和-*跃迁的结构单元称为生色团（如：-C=C-、-C=N、-C=O等）助色团含有非键电子对，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。FCH3ClBrOHOCH3NH2NHCH3 N(CH3)2 NHC6H5O-XNR2SRORBrClmax9585503020助色原因：n-共轭或超共轭（烷基，弱）11-2-4 UV-Vis中常用术语（2）11-2-5 影响UV-Vis光谱的因素共轭效应（核心因素）空间效应pH的影响溶剂的影响共轭效应（1）共轭效应（2）化合物乙烯丁二烯己三烯辛四烯

12、结构式CH2=CH2max1852172582961.01042.11043.51045.2104EEEE4*5*6*32132145*6*7*8*3*4*2112*共轭效应（3）En* n *290 nm *210 nmn*4 1n *321 nm *217 nm 2*3脂肪醛的 * n *2-丁烯醛的 2 *3 n *3空间效应A-H；B-CH3；C-CH2CH3；D-CH2CH2CH3；E-CH2CH2CH2CH3；F-2,4,6-三丁基pH的影响（1）苯胺 pKb= 9.3介质KB水230280酸203254苯酚 pKa= 9.95介质KB水210.5270碱235287 A20025

13、0300230280中性酸性苯胺UV吸收光谱图pH的影响（2）酸碱条件改变导致物质结构发生变化溶剂的影响（1）1. 蒸气状态2. 环己烷中3. 水中溶剂极性增大，溶质分子吸收峰的振动精细结构逐渐消失吸光度溶剂的影响（2）溶剂极性对n*和*跃迁能量的影响能 量溶剂极性对异丙叉丙酮跃迁谱带的影响跃迁类型正己烷氯仿甲醇水n*329 nm315 nm309 nm305 nm蓝移*230 nm238 nm237 nm243 nm红移如何估算氢键的强度？UV-Vis光谱法中溶剂的选择基本要求对溶剂有很好的溶解性；自身稳定，对溶 质惰性；在样品的吸收光谱区无明显吸收；低极性（定性分析）溶剂截止/nm溶剂截止

14、/nm溶剂截止/nmCHCl3245乙醚210苯280环己烷210己烷210CCl4265正丁醇210庚烷210DMF270二氯甲烷235甲醇215丙酮330二氧六环235异辛烷210吡啶303乙醇215水210硝基甲烷380常用溶剂的光学透明区11-3 Lambert-Beer定律（1）透射比和吸光度透射比T（透光度、透过率）吸光度A（光密度D or O.D.，消光度E ）A与T的关系（0T%100）（0A）11-3 Lambert-Beer定律（2）前提：入射光为单色光Lambert定律（1760）：吸光物质浓度不变Beer定律（1852年）：光程不变L-B定律k、k、k：比例系数，与溶液

15、性质、入射光波长及温度有关l：光程c：吸光物质浓度11-3 Lambert-Beer定律（3）比例系数k的几种表达方式 摩尔吸光系数 吸光系数a比吸光系数 A：无量纲；l：cmc ：molL-1； ：Lmol-1cm-1 c ：gL-1；a ：Lg-1cm-1 c：%； ：100cm-1 摩尔吸光系数数值上等于吸光物质浓度为1 molL-1，光程为1 cm时的吸光度（测定该值需用稀的标准溶液）由吸光物质本身性质决定，当测定条件如入射光波长，溶剂等条件确定时，该值可作为吸光物质的一个特征参数（定性）可用作吸光能力和测定方法灵敏度的度量 5105（高）与吸光系数和比吸光系数的换算M为吸光物质的分子

16、量11-5 Lambert-Beer定律（4）L-B定律的适用性入射光为单色平行光待测物为均一的稀溶液、气体等，无溶质、溶剂及悬浊物引起的散射局限性：样品吸光度 A 与光程 l 总是成正比；但l 一定时，A 与 c 并不总是成正比，即会发生Beer定律的偏离！这种偏离由样品性质和仪器自身引起的。1. 无偏离2. 正偏离3. 负偏离样品性质影响浓度过高，吸光质点间距变小而相互影响，以致对特定辐射的吸收能力（）发生变化。（稀溶液：c0.01 molL-1）待测组分的离解、缔合、逐级配位、互变异构、光化学反应以及与溶剂的相互作用都可能引起对Beer定律的偏离。溶液必须使均相体系！胶体、乳胶、悬浮物、

17、沉淀等非均相体系产生的光散射会引起对Beer定律的偏离。离子强度过大或待测样品在待测波长的发射荧光、磷光亦可能引起对Beer定律的偏离。104/nm亚甲基阳离子水溶液形成二聚体仪器因素（非单色光）假设入射光仅由测量波长x和干扰i波长组成，则吸光度A可用下式表示：仅当i=x时上式成立，否则产生对Beer定律的偏离！应尽量使入射光“带宽”内的保持一致！max处测定，灵敏度高，对Beer定律的符合程度也好应根据实际情况调节适当“带宽”11-4 Lambert-Beer定律（5）吸光度的加和性溶液中存在多个吸光物质，且它们彼此之间没有相互作用时，L-B定律可用下式表示：待测组分吸光度测定及多组分同时测

18、定的理论基础。待测组分吸光度A的测定选择适当的参比溶液是关键吸收池也应匹配T0.5%11-4 紫外-可见分光光度计（1）基本部件光源单色器吸收池检测器光电管、光电倍增管二极管阵列、CCD石英：UV-Vis玻璃：Vis棱镜光栅UV：D2 灯Vis：WI灯UV-Vis：Xe灯信号指示分类：单光束、双光束、双波长、多通道、探头式等光源氘灯：160375 nm钨灯：320-2500 nm氙灯：250-700 nm氘灯示意图 单色器（波长选择器）（1）单色器的作用是将复合光分解成单色光，并使相应波长的单色光进入到检测器。由入射狭缝和出射狭缝、准直镜以及色散元件（如棱镜或光栅等）组成。不存在绝对意义上的单

19、色光，均是具有一定宽度（带宽）的谱带使用滤光片或干涉仪+傅里叶变换方式也可以获得光谱图单色器（2）光栅公式光栅法线入射光衍射光：入射角：衍射角（与在光栅法线同侧取正，异侧取负）d：光栅常数n：光谱级数：闪耀角控制适当的闪耀角，使最大光强出现在所需级次（通常为1级）的光谱上单色器（3）光栅分光系统焦面出射狭缝入射狭缝反射光栅凹面镜S = DWD：线色散率倒数W：狭缝宽度S：“单色光”的带宽检测器光电转换器：将光辐射转化为可测电信号的器件单道检测器：光电管或光电倍增管等（某一时刻仅能检测某一波长的光强，绘制光谱图时需按波长顺序逐一扫描测定，需要一定时间。多道检测器：二极管阵列（线检测器）或CCD面

20、检测器（n个单道检测器的集成，能同时检测各个波长的光强，可“瞬间”完成光谱图的测定）光电倍增管（PMT）优点：高灵敏度；响应快；适于弱光测定，甚至可对单一光子响应缺点：对外加电压变化极为敏感，必须严格控制电压；热发射强，暗电流大；不适合在温度波动较大或高温下工作，不得置于强光（如日光）下，否则可永久损坏 PMT！单光束分光光度计仪器框图特点简单、便宜、操作方便，用于常规定量分析。通常只配备可见光源，玻璃吸收池通常不具备自动扫描功能，绘制光谱图不方便。722型可见分光光度计吸光度A的测定：选定波长后，将参比池放入光路，调节A=0或T=100%（目的：把入射光强调整为透过参比池的光强），然后把样品

21、池放入光路，即可得样品的吸光度。双光束分光光度计（1）仪器框图特点通常采用双光源（D2、WI），适用全波段（200-800 nm）具有自动扫描功能比切光器频率慢的光源和检测器波动不影响测定入射光交替通过参比池/样品池进入检测器双光束分光光度计（2）吸光度A的测定参比池与样品池同时放入相应的位置，直接可测得A。具有自动扣除“Baseline”功能，可消除样品池的差异：参比池和样品池内都装入参比溶液，在设定波段内扫描即可得“Baseline”Varian Cary 1E 紫外可见分光光度计双波长分光光度计1和2交替通过样品池进入检测器特点：不需参比液（消除了由参比池不同和参比溶液选择等产生的误差）

22、。可用于混浊试样、高浓度试样、多组份试样的测定；还可以测定导数光谱。 多通道分光光度计无需扫描，可在极短的时间内（104）且无干扰物质存在，可直接进行定量测定；但部分有机物如氨基酸、糖和大部分无机离子如Fe3+、Al3+、NO2-类的很小，该怎么测定呢？显色反应：利用配位（最常见）、氧化还原、偶氮化等反应使待测物质定量转化为的足够大的化合物（有色）配位显色剂种类无机显色剂（SCN-；MoO42-；H2O2）有机显色剂OO型：磺基水杨酸NN型：邻二氮菲ON型：4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚 S型：双硫腙常见无机离子显色剂请参阅现代化学试剂手册第四分册显色剂的选择原则反应生成物必须有足够大的和较高

23、的选择性反应生成物组成恒定、稳定性好、显色条件易控制对照性要好，生成物与显色剂的max60 nm显色剂确定后，还必须要控制适当的显色条件原本可直接测定的物质通过适当的显色反应可以进一步提高灵敏度和选择性，如蛋白质、核酸等。11-5-2 定量分析条件的选择（1）仪器测量条件显色反应条件参比溶液的选择干扰及消除方法（了解）提高灵敏度及选择性的方法（了解）仪器测量条件（1）吸收光谱法仪器的响应值I和I：由光源、检测器的波动等各种偶然因素造成对于确定的仪器，T为定值，一般为0.22%T与c非线性关系。不同T对应不同的c，相同T（读数误差）在不同T处产生的c也不同。测定误差c/c随着T的增加会呈现出何种

24、变化趋势呢？1086420204060800.70.40.20.1AT%仪器测量条件（2）100806040200T% c仪器测量条件（3）当T36.8，A0.434， Er最小。实际工作中，最好控制A在0.151.0（T在1070%）之间（T=1%，Er5%）可通过改变试样量、稀释试液或选用不同光程的吸收池来实现 采用高性能高仪器（T小）或允许误差大时，A的取值范围可以变宽，但也不宜过浓。 测定波长的选择：max（首选）出射狭缝宽度的选择（低端仪器无此选项）例：某钢样含镍约为0.12%，采用丁二酮肟光度法测定，过程如下：试样溶解后转入100 mL容量瓶中，显色后定容；然后取部分试液在波长47

25、0 nm处用1 cm吸收池进行测量。如果希望此时的测量误差最小，应称取试样多少克？（已知有色配合物的=1.3104镍的原子量= 58.69）称样的最适质量范围？显色反应条件（1）显色剂用量、溶液pH、反应温度及时间等显色反应条件均会影响到测定结果的重现性和准确度，因此在进行定量分析前需对其进行优化。通常采取单因素实验法，即在其他影响因素固定的前提下（通过文献调研或预作来确定相应的数值），只改变待考察因素，测定仪器响应（吸光度）并绘制相应曲线，根据曲线形状来确定该因素的最佳取值。显色反应条件（2）显色剂R用量选择曲线平台处对应的显色剂用量作为最佳显色剂用量常见形式显色反应条件（3）显色反应pH显

26、色反应的完成度、配位数和待测离子是否发生水解等与 pH 有关，需通过实验确定最佳pH值 ，缓冲溶液控制。pH1pHpH2显色反应条件（4）确定显色温度及显色时间T1(C)T2(C)t1(min)t2(min)T(C)t(min)如果存在其它影响因素，也应采用相同的实验方法确定最适条件。参比溶液的选择（1）试样：待测组分+基体（与试样来源有关）待测液：待测组分+基体+相关试剂+溶剂理想空白：基体（ ）+相关试剂+溶剂若测定条件下基体及所用试剂均无吸收，则可用溶剂参比若测定条件下基体无吸收，则可用试剂参比，即相关试剂+溶剂（最常用的参比形式）若存在基体干扰，可尽量通过显色剂选择、测定条件优化或掩蔽

27、、分离等方式消除基体的影响，这样还可以用试剂参比）参比溶液的选择（2）若上述手段无效，则需更换其他参比，譬如：试样参比：若仅存在基体干扰且干扰成分与显色剂不反应（显色剂和其他试剂无干扰），可采用试样参比（除不加显色剂，其他步骤与试样处理相同）。平行操作溶液参比：用不含被测组分的试样（基体一致），在相同条件下与被测组分进行同样的处理，然后做为参比。系列标准溶液待测液试剂参比本实验所用显色剂和其他试剂在测定波长处无吸收，因此也可用水做参比（溶剂参比），但实际测定中通常是采用试剂参比。若水样中存在干扰物质，待测液需选用合适的参比溶液或采取适当的手段。例：邻二氮菲显色法测定水样中微量铁水样处理：用适量

28、HCl酸化采集试样（浑浊液则需过滤或进行其他处理；粗测后决定试样是否需稀释或浓缩）标准系列及试样溶液的配制容量瓶（50 mL）编号0 123456100 mgL-1 Fe2+溶液/mL00.30.60.91.21.55.010盐酸羟胺水溶液 /mL1111111混匀后放置3-5 min0.2邻菲啰啉溶液/mL1.51.51.51.51.51.51.5pH4.6的HAc-NaCl缓冲液5555555定容至50mL，放置10 min后于510 nm处测定A干扰及消除方法（1）干扰的产生原因干扰物质本身或与显色剂作用后在测定波长下也有吸收；干扰物质与显色剂或被测物质形成稳定的配合物，使显色反应完成度

29、降低或不能进行；显色条件下，干扰物质水解形成沉淀，造成溶液浑浊而干扰吸光度的测定。干扰及消除方法（2）选择适当的测量波长原则：干扰最小，灵敏度最大，尽量选在峰顶处选择适当的掩蔽剂（如铬天青S测定铝，钴和镍的干扰）控制酸度利用生成配合物的稳定性不同分离双波长或导数光谱法钴-亚硝基红亚硝基红提高灵敏度及选择性的方法合成新的高灵敏度有机显色剂采用分离富集（萃取等）和测定相结合采用三元（多元）配合物显色体系分子截面积增大；电子跃迁几率增大主要类型：三元离子缔合物、三元混配配合物、三元胶束（增溶）配合物11-5-3 其他定量分析方法多组分的测定示差光度法光度滴定法（自学）双波长分光光度法（自学）导数分光光度法（自学）多组份定量方法以2组份为例由x，y标液在1，2处分别测得二元一次方程理论上可用于多组份的测定，但实际较少用（误差大）x、y互不干扰，各在max处测定x、y相互干扰x干