医检细胞因子及其受体检测

1、第二十五章细胞因子及其受体检测 陶 洪 群1学习要点：生物学检测方法的种类、原理和技术要点免疫学检测方法的种类分子生物学检测方法的种类比较三种细胞因子检测方法的优缺点检测细胞因子受体的常用方法2细胞因子:是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。 生物学作用:抗感染和抗肿瘤; 免疫调节作用; 刺激造血细胞增殖分化; 参与和调节炎症反应发挥效应的特点:非特异性;多效性;重叠性;拮抗性; 协同性;增强性;网络性3 细胞因子的种类 -六大类（按功能分类）： 白细胞介素（interleukins，ILs） 干扰素(i

2、nterferon，IFN) 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） 集落刺激因子(colony- stimulating factor，CSF) 趋化因子（chemokines） 生长因子（growth factor，GF）4细胞因子检测方法生物学检测法免疫学检测法 临床上最常用分子生物学检测法5第一节 生物学检测法基本原理:结果以活性单位(U/ml)表示6 原理:利用某一细胞因子可促进相应指示细胞分裂、增殖,将不同浓度的细胞因子（标准品或待测样品）与指示细胞共同孵育一定的时间，检测细胞的增殖情况，从而估计细胞因子的活性水平。一、细胞增殖法白细胞介素的测定7指示细

3、胞：短期培养细胞；依赖细胞株（系）；依赖细胞株是指人们为检测某一种细胞因子而筛选的，该细胞株的分裂增殖只依赖于某一种细胞因子的存在，并在一定浓度范围内与细胞增殖程度呈正相关。若培养基中缺乏这种细胞因子，依赖株则不能存活。 IL-2指示细胞：CTLL（小鼠杀伤性T细胞系） 指示细胞8技术要点 依赖细胞株的准备 细胞因子作用于依赖细胞株 测定细胞增殖程度 细胞因子活性单位的计算 细胞因子的生物活性单位是指使相应细胞达到最大程度增殖的50时所需细胞因子的含量为一个活性单位 。 待测样品50最大程度增殖的稀释度 细胞因子活性（U/ml） 标准品的细胞因子活性单位 标准品50最大程度增殖的稀释度9直接计

4、数法 简便、直观,但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化 3H-TdR掺入法 通过细胞DNA合成的增加间接判断 MTT比色法 以细胞的代谢物作为细胞增殖指示物间接判断 代谢产物可被二甲基亚砜或酸化的异丙醇所溶解而显色，测定波长为570nm，参考波长为630nm。细胞增殖检测方法10 IL-2依赖的CTLL用10FCS-RPMI1640洗涤2次， 每次1000rpm, 5min, 除去原培养液中的IL-2 调整活细胞数110ml 96孔平底培养板中每孔加入100l不同稀释度标准IL-2和待测样品 每孔加100l CTLL悬液 37CO2孵箱，培养1824h 每孔加H-TdR 4-6h 用细胞

5、收集仪收获于玻璃纤维纸上 于液闪仪中测射线的cpm值 IL-2生物活性的测定 11 基本原理：对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡(细胞毒性反应)。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。二、靶细胞杀伤或抑制法主要用于肿瘤坏死因子（TNF）的生物活性测定 TNF敏感株：小鼠成纤维细胞株L929和WEHI 164.13 12技术要点靶细胞的准备 TNF作用于靶细胞 细胞毒性反应程度测定 TNF活性计算 导致50%细胞死亡的样品最大稀释度TNF活性单位（U/ml） 标准品TNF活性单位

6、导致50%细胞死亡的标准品最大稀释度13细胞毒反应程度测定：检测死亡的细胞:51Cr释放法、台盼兰染色检测剩余活细胞的数量间接判断 3H-TdR掺入法、MTT比色法、 结晶紫染色法:活细胞染色而死细胞不着色， 柠檬酸钠缓冲液脱色，测A570nm14取对数生长期的L929细胞，以001胰蛋白酶消化用培养液调整细胞浓度至2105mL。培养板中每孔加入100L细胞悬液，置37，5C02温箱孵育24h。 每孔分别加入100L稀释样品或标准品 各孔加入10L放线菌素D，371214h。 离心弃上清，并用PBS洗细胞一次。 每孔加入025结晶紫 100uL，室温下染色10min。 离心弃上清，用PBS洗一

7、次。 室温下晾干，每孔加入100uL柠檬酸钠缓冲液 570nm波长下测OD值。 TNF生物学活性测定15常用于IFN等的测定，IFN可诱导细胞产生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染从而抑制细胞病变。三、细胞病变抑制法Wish、Hep2 人干扰素L929 小鼠干扰素A549 大鼠干扰素MDBK 多种属的IFN-和IFN-VSV、EMCV等常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于攻击细胞的病毒最常用的检测系统： Wish细胞-VSV16 96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN， 每孔50l，病毒对照不加IFN 每孔加入100l 1.5210 ml Wish 或Hep-2细胞悬

8、液， 孵箱培养612h， 每孔加入VSV, 细胞对照不加病毒液 终止培养前34h加入5mgml MTT, 15L孔 加入适量生理盐水，用滴管轻轻吹吸弃去悬浮病变细胞和死细胞 200l孔 二甲亚砜，作用10min 测OD(570nm),表示活细胞中含甲臜的量， 测定IFN对活细胞的保护水平 IFN的生物学活性测定17四、趋化活性测定法 IL-8、IL-16、MCP（单核细胞趋化蛋白）的生物活性测定Boyden 小室法 18优点生物学活性的测定灵敏度高不需商品化试剂盒，成本低缺点特异性差操作繁琐易受干扰五、生物学检测法的评价19第二节 免疫学检测法 ELISA 首选方法 放射免疫分析 流式细胞分析

9、法酶联免疫斑点实验可溶性细胞因子细胞内细胞因子20免疫学检测法的评价缺点：测定的是细胞因子的蛋白含量，与生物活性不一定呈正相关，有时与临床症状不一致。不同来源亲和力的单抗对同一标本测定结果可能不同敏感度不如生物学测定法标本中存在的细胞因子受体、细胞因子结合蛋白有干扰优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化21第三节 分子生物学检测 细胞因子的DNA检测 Southern印迹杂交 斑点印迹杂交 聚合酶链反应（PCR） 原位杂交和原位PCR 22细胞因子mRNA表达的测定 原位杂交RT-PCR原位RT-PCR 23分子生物学检测方法的评价 可对细胞因子的基因突变、缺失、重排及染色体易位等进行检测。原位杂交和原位PCR，可分析病理情况下何种细胞中细胞因子的基因发生异常，揭示细胞中细胞因子基因特定改变及其表达，究竟发生在细胞增殖的哪个阶段。 技术复杂 ,实验室条件要求严格 24第四节 细胞因子受体检测技术膜结合受体的测定可溶性受体的测定25细胞因子测定的临床