《转基因食品生物技术及安全性评价》课件3转基因食品31

1、五、转基因作物的遗传特点 5.1.外源DNA的整合位点和拷贝数5.1.1.外源DNA的整合位点转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的，外源DNA可以插入植物基因组的任何一条染色体和一条染色体的任何位点，但往往对转录活性区域具有插入特性5.1.外源DNA插入的拷贝数外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单拷贝单位点插入串联多拷贝单位点插入多拷贝多位点插入5.2 外源DNA整合的遗传效应5.2.1位置效应不同的插入位点遗传背景不同，表达水平不一致外源基因插入的位置效应也可引起转基因得失活5.2.2 重组效应转基因可在寄主体内发生缺失、重排、易位和重复5.2.3. 转基因沉默顺式失活：多拷贝，串联插入导

2、致倒位或直接重复引起失活反式失活：在顺式失活的作用下引起其它位点的失活共抑制：转基因引起内源同源基因的沉默六、用于植物性转基因食品的目的基因6.1 抗虫基因作物不喷药喷药小麦52%20%水稻83%10%玉米59%10%-20%大豆58%5%- 10%棉花84% 30%全球粮食总产量每年因虫害造成的损失达14%6.1.1.苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因（ICP)：苏云金杆菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，在芽孢形成过程中，产生大量的具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成的伴晶体。 特点：无活性毒素原蛋白由1187个氨基酸组成，毒性片断为68 kD转基因作物：番茄、甘蓝、玉米、水稻、马铃薯等 缺点：抗虫谱窄 昆虫

3、易产生耐受性.1.2蛋白酶抑制基因（proteinase inhibitor,PI)植物中蛋白酶抑制剂主要有三种： 丝氨酸蛋白酶抑制剂（豇豆胰蛋白酶抑制剂（copea trypsin inhibitor,Cpt1)巯基蛋白酶抑制剂金属蛋白酶抑制剂特点：作用与昆虫消化酶的活性中心，产生突变的可能性 小；抗虫谱广泛，对人畜没有毒副作用6.1.3 植物外源凝集素基因（lectin) 植物外源凝集素是非免疫来源的糖蛋白或结合糖的蛋白质，能与昆虫消化道中的糖蛋白结合，影响营养的吸收，促进消化道内细菌的繁殖，进而对害虫造成伤害6.2 抗病基因6.2.1.抗植物病毒基因导入病毒外壳蛋白；利用反义RNA技术6

4、.2.2抗植物真菌病基因增强细胞壁结构和诱导产生或激活抗菌物质（几丁质酶；，葡聚糖酶）6.2.抗植物细菌病基因抗假单孢杆菌基因；杀菌肽基因和溶菌酶基因耐除草剂的基因工程主要有两种策略： 修饰除草剂作用的靶蛋白 引入酶或酶系统抗除草剂基因分三类： 抗EPSPS抑制剂基因 抗AIS抑制剂基因 抗光合系统除草剂基因6.3 抗除草剂基因6.4.抗逆基因6.4.1.抗低温基因 鱼类抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)6.4.2抗渗透胁迫（抗旱、抗盐）基因 甜菜碱和脯氨酸是主要的渗透调节物质 胆碱单加氧酶（cholinemonooxygenase,CMO) 甜菜碱醛脱氢酶(betai

5、ne aldehyde dehydrogenase, BADH) 转录因子DREB家族基因 调渗蛋白(osmotin, OSM)6.5.果实保鲜基因基因操作果实成熟过程中可操纵因子有两项： 乙烯合成途径中的限速酶,ACC合成酶（ACS)和ACC氧化酶(ACO)；果实细胞壁结构变化中的可控因子：半乳糖醛酸酶（polyoalacturonase, PG)6.6.改善作物质量和产量的基因6.6.1.提高作物产量的基因 从C3途径到C4途径的转换 提高磷酸蔗糖合成酶和淀粉合成酶的活性6.6.2.改良种子贮藏蛋白营养品质的基因 1、修饰自身种子的贮藏蛋白基因，改变其氨基酸的组成 2、导入外源种子的贮藏蛋

6、白基因，增加某种氨基酸的含量 3、 人工合成种子的贮藏蛋白基因，改善种子蛋白的含量6.6.3.改良植物油脂品质的基因：增加饱和脂肪酸的含量增加不饱和脂肪酸的含量6.6.4.调节碳水化合物合成的基因 控制淀粉合成的基因、葡萄糖焦磷酸化酶基因（AGPase)、淀粉合成酶（GBSS)和分支酶基因(BE)第二节 转基因动物的制作方法一、受精卵雄原核显微注射法二、胚胎干细胞（ES细胞）法三、逆转录病毒感染法四、体细胞核移植法五、精子载体法六、YAC法七、磷酸钙沉淀法八、脂质体法 转基因动物操作技术流程 获取和构建外源目的基因 含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的受精卵移植

7、到母体子宫 转基因胚胎的发育及鉴定 检测新基因的遗传性和表达能力简明操作步骤一、雄原核显微注射法 以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法。 这一方法的实验程序如下：载体DNA制备 受精卵准备胚胎操作过程显微注射 假孕母鼠准备(养母) 胚胎移植对幼鼠鉴定 用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5。因此人们往往来用增大微注射受精卵的数目的办法来弥补这一缺陷。优点：外源DNA大

8、小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观；整合率高缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默注意事项：1. 显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞后，在染色体上的整合位置是随机的2. 外源基因甲基化程度在胚胎发育过程中会影响其活性3. 某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常调节机制的控制4. 由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具有一定的组织特异性2、胚胎干细胞（ES细胞）法 ES细胞是早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系。 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及

9、转基因动物。 它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。 优点：外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的),

10、 获得转基因动物的方法。目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。3、逆转录病毒感染法 优点： 受精卵携带外源基因的阳性率高 外源基因多单拷贝整合 操作简单，避免注射法对卵子的损害 宿主范围广 可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 缺点： 容纳大小有限 潜在致癌性,载体复杂 整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性4、体细胞核移植法（转基因克隆） 将外源基因导入到体细胞中，再将该细胞进行培养，选择其中带有外源基因的细胞进行扩增，用这种细胞的细胞核进行核移植（把体细胞核植入一个去了核的卵母细胞中，融合并激活），将重组胚进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。优点：转基因效率显著超过显微注射可以方

11、便的建立生产畜群可以预测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术已经成为标本的多莉将永远被人们记住！永恒的多莉 相关资料：克隆动物（一）几个基本概念克隆（clone，cloning） 即无性繁殖，是指由一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖所形成的一群细胞或个体。克隆动物（cloning animal） 是利用显微外科技术，将一个体细胞核移植到一个去核的卵细胞中，再植入母体子宫，便可不经授精而发育成的一类动物。全能性（totipotency），哈布兰德1902年提出全能性学说，该学说认为任何一个处于细胞分化临界期之前的细胞，只要处于合适的条件下，既可发育为完整的生物体，也可发育为任何组织、器

12、官及其任何终末细胞。多能性 指具备分化为多种组织、器官及终末细胞的能力。供体（donor） 提供细胞核的一方。受体（receptor） 接受细胞核的一方。 体细胞克隆技术 1997年2月17日是1个让全世界震惊的日子，英国Roslin研究所的Wilmut从1只六岁母羊的乳腺上皮细胞成功的克隆到了一只绵羊一多利(Dolly)。这是人类第一次采用分化的体细胞作为供体细胞，它的成功是20世纪生物学重大突破之一。学术意义在于证明分化的体细胞甚至是分化终端的体细胞核仍有全能性。（1）体细胞系的建立 ；（2）Go期的诱导；（3）卵母细胞收集和去核 （4）细胞融合与激活（5）重组胚的培养（6）胚胎移植 （7

13、）体细胞移植后代的鉴定，确定后代是否真的来源于供体细胞系细胞。 （三）动物体细胞克隆的路线 优点： 对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，不仅具有“ES细胞途径”的全部优点，且物种适用面广。无需经过嵌合体育种就可获得纯合个体，周期短，效率高。 缺点： 技术上难度大， 成功率极低， 胚胎死亡率高， 非一般实验室可以开展。 5、精子载体法 直接以精子为载体的转基因方法：将成熟精子与外源共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA 整合到染色体中。 6、YAC法 利用酵母人工染色体()作为载体制作转基因动物的方法。 酵母人工

14、染色体（）载体是近年来发展起来的新型载体, 能克隆百万对碱基的大片段。 优点：保证大片段的完整性保证较长外源片段在转基因动物研究中的整合率高 保证了目的基因上下游的侧翼序列的完整性因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。7、磷酸钙法 将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2后，DNA片段与磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而实现转基因。图2.利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染质脂体介导的基因转移8、脂质体法（lipofection）将待转染的DNA溶液与磷脂混合，后者在表面活性剂存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。当这种脂质

15、体悬液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质或细胞核内。 7.2. 转基因动物研究出现的问题 1、制作转基因动物效率低 2、外源基因在宿主基因组中的行为难以控制 3、转基因表达水平低 1、制作转基因动物效率低 这是制约这项技术广泛应用的关键。以显微注射法生产转基因动物为例，小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊转基因阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%,0.9%。 2、基因在宿主基因组中的行为难以控制 转基因随机整合于动物的基因组中，很有可能引起宿主细胞染色体的插入突变，还可造成插入位点的基因片段的丢失及插入位点的基因的位移，同时也可能激活正常情况下处于

16、关闭的基因。其结果导致转基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常现象。 3、转基因表达水平低许多转基因的表达水平受到宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平较低,极少部分表达水平过高。 进行功能基因组学的研究，研究外源基因在动物整体水平的表达调控规律。转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究也可改变动物基因使其表现型更适合人类需要还可以用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。 7.3. 转基因动物的意义生物制药产业化特点高技术：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透高投入：在国外，一个生物药品平均要投入13亿美元，并随着

17、开发难度的增大,有逐步增高的趋势长周期：国际上，一个新的生物药品需要68年时间高风险: 一个新药品的开发，经过一系列的程序-研发、中试、动物实验、IIII期临床实验，上市和严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃高回报: 开发成功一个新的生物药品, 回报很高。如美国Amgen公司，首次开发上市的EPO、G-SCF到1997年的销售额分别接近和达到20亿美元基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子 231元/ug红细胞生成素 1072元/ug白细胞介素-2 410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元/ug胰岛素 10.2元/mg全球生物科技公司前10名公司名称市值（美元）业务领

18、域Amgen安进$554亿生物制药Gilead Sciences吉利德$381亿生物制药Biogen Idec生物基因$335亿生物制药Celgene赛尔基因$300亿生物制药Shire夏尔$167亿生物制药Alexion Pharmaceuticals亚力兄$158亿生物制药Vertex Pharmaceuticals福泰$130亿生物制药Regeneron Pharmaceuticals再生元$112亿生物制药Life Technologies生命科技$76亿实验试剂与器材，测序技术Illumina伊鲁米那$53亿测序技术生物技术产业发展情况 美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种

19、类 产品数量 疾病种类 产品数量感染性疾病 39 心脏病 26神经系统疾病 28 呼吸系统疾病 22艾滋病及相关疾病 19 自主免疫系统疾病 19皮肤病 19 移植 13消化系统疾病 11 遗传疾病 11血液疾病 9 糖尿病及并发症 7不育症 5 眼病 3生长发育不良症 3 骨质疏松 2妊娠预防 2 肿瘤疾病 175 从基因的角度重新认识疾病，运用基因技术预防和治疗疾病、鉴定身份，器官再造，运用基因技术防止新生儿疾病甚至设计更加“完美”的新生儿，培育新的动植物品种 虽然目前基因技术大多数尚待完善，其发展和应用的前景却未可限量，这使人们看到了可以拥有一个更加美好世界的可能性。 但另一方面，随着基

20、因技术日益深入、广泛地干预生命，许多人也产生了诸多忧虑，从伦理、道德、法律、社会的角度来重新审视基因技术的应用。分子医学 根据卡普等的定义，分子医学的内容包括: 发现控制正常细胞行为的基本分子 弄清基因异常与疾病发生的关系 通过检查和纠正这些异常基因对疾病进行诊断、治疗和预防 分子医学与传统医学的主要不同在于前者对疾病的认识和操作都是在分子和基因水平上进行的。 分子医学的基本内容:疾病的分子机理 疾病的基因诊断 疾病的基因治疗 疾病的基因预防 分子医学的社会、伦理问题 探索疾病的原因，是有效治疗疾病的前提。目前，医学对某些还缺少有效的治疗方法，就是因为对病因缺乏深入的认识。基因科学的发展，为人

21、类从细胞内部的微观生理学和分子生物学水平上寻找病因提供了新的思路。疾病的分子机理 英国女王维多利亚。她带有血友病的基因，并将其传给了她的儿女。血友病是一种遗传性凝血障碍疾病，患者可能因很小的伤口而出血不止导致死亡。血友病在女性一般表现为隐性遗传，较少发病，但会传给后代；在男性则表现为显性遗传，显示出病症。维多利亚女王在科堡主持的一次欧洲王室成员集会，与会者有17人是她的后裔，其中有她的孙女亚历山德拉（21），她同俄国沙皇尼古拉二世结婚，导致他们的儿子患有血友病。 1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。 美国毕晓普和瓦慕斯等人的研究表明：动物体内的癌

22、基因不是来自病毒，而是由于在动物的正常细胞基因中本来就存在一个庞大的癌基因族，正常情况下这些原癌基因是不活跃的，但当受到病毒入侵或遇到物理、化学等因素作用时，就可能被激活，突变为癌基因。这也就解释了化学污染、吸烟、放射线辐射等因素致癌的原因。 一个外科庸医正在从一个痴呆的精神病患者头上取出“愚人之石”，该画是16世纪博希所画，以讽刺那个时代人们的无知。但在基因时代，如果真能取出致病的基因，那么这名患者也许就有救了。 美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。 1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治

23、疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将含有这个女孩自己的白血球的溶液输入她左臂的一条静脉血管中，这种白血球都已经过改造，有缺陷的基因已经被健康的基因所替代。在以后的10个月内她又接受了7次这样的治疗，同时也接受酶治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。 谢德尔，1999基因治疗功效神奇松鼠猴“视界”五彩斑斓 基因治疗临床试验所涉及的疾病 基因治疗临床试验批准数年度变化曲线 时钟基因与抗衰老 人类从公元3500年前就开始寻找长生不老药。老化的原因有多种因素，如蛋白质损伤、DNA损伤、细胞膜损伤、细

24、胞内积累废弃物、端粒缩短等。提升寿命上限的目标可以通过多种方法实现，除了治疗疾病、均衡营养、减少环境污染、适量运动等方法外，发掘控制衰老或长寿的基因成为最有潜力的途径之一。 “时钟基因”： 破坏“时钟1基因”（clock 1 gene）可使线虫的寿命延长1.5倍。科学家们发现，人类也有与时钟1基因大致相同的基因。 “年龄1基因”（age 1）、“daf-2”等受损会延长寿命的基因。人类的DNA中原来就有负责化解活性氧毒性的基因，我们也可以采取活化该基因的办法，以防止老化。 热量限制可以延长包括哺乳动物在内的许多物种动物的生命周期。限制热量摄入而延长生命的现象与一种叫作SIR2基因有关。 “我还

25、活着”基因一旦发生改变，就会使果蝇寿命延长一倍。 人体内也存在这种基因，它是通过改变新陈代谢来发挥作用的。 DNA缠绕成的染色体末端，有称做端粒（telomere）的区域。控制着细胞的分裂次数，端粒随着细胞分裂每次变短，短到某个程度，细胞将不再分裂。人的一生中，细胞大约能分裂5060次。因此端粒是控制生理寿命的生物钟，而端粒长短就成为表示细胞“年龄”的指标。如果加入一种“端粒酶”阻止它缩短，就可使细胞保持年轻，人就像吃了“唐僧肉”一样实现长生不老的梦想。 中国基因工程制药200多家生物技术公司生物技术药品产值：1996-18亿元；1997-30亿元；2000-72亿元可生产药物品种：约20种 国内产业化生物药品概况产品种类 临床I 临床II 临床III 批准上市凝血因子 VII IX VIII细胞刺激因子 SCF TPO G-CSF, M-CSF,EPO生长因子 骨形成因子 肌营养因子 FGF，GM-CSF 胰岛素类似物 血小板衍生因子 HGH EGF干扰素 IFN, 1b, 1b , 2a, n3 , 1b, , 1b白介素 1 , 1 3, 6, 2, 4, 12 11激素 人促卵泡素 甲状旁腺素 胰高血糖素 胰岛素，心钠素 降钙素 促黄体生成素 I