《转基因食品生物技术及安全性评价》课件5转基因食品5

1、三. GMO检测常用技术方法 聚合酶链反应（PCR）技术 核酸分子杂交技术 免疫检测技术 生物芯片 （一）聚合酶链式反应技术PCR技术简史 PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用DNA， 生命的蓝图PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGA

2、TCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了凯利穆利斯（Kary Mullis），1944年出生，1962年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业.受同学们的蛊惑，1

3、966年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。1968年一个人在NATURE发表“时间反演的宇宙学意义”论文并侥幸通过了博士生资格考试。1972年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。毕业后，尝试写小说，但因“不能使一部分人物具有不幸的遭遇”而失败，又因厌恶天天宰杀实验小鼠而两次丢掉工作。他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段辞职。以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特斯公司，负责DNA合成。正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。198

4、3年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。” 普遍的观点是，不仅我不够聪明，没看出问题的要害，而且肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引

5、物）去扩增模板DNA 的想法.很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。“SCIENCE”确实在1985年发表

6、了第一篇关于PCR的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述PCR技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：“这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊有限的版面。”1989年12月， 著名的自然科学杂志“SCIENCE”将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。主编Daniel Koshland Jr. 写道：第一篇有关PCR的论文发表于1985年。自那以后，PCR已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。 有了PCR，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材

7、料。PCR仪器的变迁三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的）电加热块 自来水冷却 （PE，1988）电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989）三个加热块 机械手 （Stratagene，1994）半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）PCR不只是一个方法改进Mullis的

8、上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。PCR的发展史1983年春，Mullis提出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断；1985年10月25日申请了PCR的专利。1985年12月20日，Mullis的同事S

9、aiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人1988年，第一台PCR仪问世；1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 PCR是体外基因扩增技术。是一种在体外由一对引物介导的DNA聚合酶催化的DNA聚

10、合反应，它利用体内DNA复制的原理和DNA变性与复性的性质，能够在短时间内快速准确地进行目的基因DNA的大量扩增。聚合酶链式反应技术(PCR，polymerase chain reaction)2. PCR基本原理： PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增100万倍以上。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.

11、12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L 3.1. PCR各要素及其作用（1） 模板 PCR模板可以是单、双链DNA DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为100ng DNA ；不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 RNA作为模板时，需要： RNA cDNA PCR, 称此为RT-PCR. 逆转录逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增（2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，95半衰期为40分钟。从而保证PCR在94变性 55退火7

12、1延伸循环30次过程中不变性失活。在PCR中，Taq DNA聚合酶应用最广泛。Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)温度()40 50 60 70 80 90 100 80 60 40 20（3）引物引物浓度 0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降,容易形成引物二聚体。 引物是根据已知序列的模板DNA待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1530个碱基。 引物是保证PCR扩增产物的大

13、小和特异性的关键因素，其设计与合成对PCR的成功至关重要。 引物设计原则如下： 引物设计应符合以下基本原则： 长度适宜，一般为1530个碱基； G+C含量，一般为4555； 4种碱基应随机性分布； 引物自身不应存在互补序列； 两个引物之间不应有多于4个碱基的互补； 引物3端末位碱基不要用A,最好用T； 引物5可以修饰。（4）dNTP PCR一般用200mol/L的dNTP； 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）缓冲溶液与Mg2+PCR技术常用1015mmol/L Tris

14、-HCl、 50mmol/LKCl Ph8.38.8、偏碱缓冲液；并含有一定量的Mg2+浓度； Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。最适1.5mmol/LMg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。（6）参数 变性温度与时间 使双链DNA解链为单链 一般选择： 940C， 30秒 退火温度与时间 取决于引物长度、浓度 和G+C含量， 一般选择： Tm - 5 时间 30秒 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温

15、度可增加反应的灵敏性。 延伸温度与时间 一般选择： 72 时间 取决于目的片段的长度循环次数 取决于模板浓度， 一般循环：30次1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍（1）DNA模板的变性 将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），并游离于反应体系中作为模板；（2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合

16、适温度（560C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3端）碱基序列互补结合。（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比例远大于模板自身的复性）；2.PCR反应过程（3）引物延伸 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3端，使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。模板DNA扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸

17、3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9556引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点56引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955672TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应

18、条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增3.2.样品设置为确保检测的真实性，除被检验样品外，试验中还应设置三个对照： 1）空白对照：无DNA模板2）阳性对照：以外源基因的重组质粒DNA为模板阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板被检样品：以转化植株基因组DNA为模板 3.3.PCR操作 各种PCR反应的操作基本相同，只是根据引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。 将PCR反应管置于DNA自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使DNA扩增在热循环仪上很方便地完成。 PCR技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快

19、速、特异地扩增任何DNA片断。 PCR缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。 3.4. PCR产物分析（1）凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。 同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。 PCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4 小时PCR具有极高的灵敏度样品正对照负对照标准分子量 污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法4.PCR的应用领域生物学领

20、域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）医学领域疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测） 4.2 PCR的类型RT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInverse PCRNested PCRReal-time PCRMulti

21、plex PCRImmuno PCRAsymmetric PCRLP-PCRRecombinant PCRIn situ PCRFlow chip PCR LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分标记引物观察PCR产物PCR产物生成曲线logDNACyclesReal LifeTheoreticalTn=T02n (T0初始模板量n:循环次数)logDNACyclesT1T2T3C2C1C3Real-Time PCR主要概念实时定量PCR荧光阈值两个重要概念Ct值两种

22、化学原理探针非探针Real-time qPCR原理如何对初始模板定量荧光信号如何产生？定义所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目的对起始模板进行定量 优点 灵敏, 重复性, 动态范围宽, 高通量原理 C(t)值与起始模板浓度的对数成反比实时荧光定量PCR原理及应用什么是C(t)值Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历循环数荧光阈值(Threshold)

23、Ct Ct值是扩增DNA的量达到阈值时候的循环次数。荧光信号穿过阈值线时的循环次数为什么要引入C(t)值CtEndpoints96 replicates of B7 gene molecular beaconCt 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Ct值定量的最佳时期logDNACyclesReal LifeTheoretical

24、如何定量标 准 曲 线 未 知 样 品 的 C(t) 值 定量 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。C(t)值与起始模板的关系 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 6-15 Real-time qPCR流程利用电

25、泳定量11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference实时荧光定量Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold difference实时荧光定量 PCR 的化学原理包括探针类和非探针类两种。非探针类则是利用荧光染料（如SYBR Green I）或者特殊设计的引物(如LUX Primers)来指示扩增的增加。探针类(TaqMan探针和 分子信标)是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。后者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但前者则简便易行。荧光染料和荧光探针常用的荧光试剂 荧光定量PCR所使用的荧

26、光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 TaqMan 探针实时PCR技术原理TaqMan 探针未结合的探针探针、引物与目的片段结合，FRET光发射或者以热量形式散失Donor dye (

27、Reporter)Acceptor dye (Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离TaqLight EmissionLight分子信标（molecular beacon）工作原理 分子信标：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度

28、下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。2）SYBR green荧光染料： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR green荧光染料，SYBR green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。ssDNA = free dye(weak fluorophore)dsDNA =Binds minor groove(intense fluorophore)SYBR

29、Green I (双链DNA结合染料)Real-Time PCR，SYBR greenCycle 1Cycle 3Cycle 2SYBR green 的优缺点简便可以使用已有的引物普遍通用可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体；需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增；价格 $1 / PCR 反应定量的灵敏度有所欠缺数字PCR（ddPCR）二、核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 GC ; DNA与RNA杂交: A=U、 GC ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链碱基互补 hybridizationDNA:DNA 5 A T G C C G A T 3T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带