耳叶苔科psbA基因适应性进化检测与分析

1、耳叶苔科psbA基因适应性进化检测与分析1210055113田益宁摘要：D1蛋白质的编码基因是 psbAo D1蛋白是光系统口( PSU)的核心亚基之一，参与维持 PSII反应中心构象的稳定和电子传递。本文以耳叶苔科植物psbA基因序列作为研究对象，利用分支模型、位点模型、分支位点模型以及FEL模型对psbA基因进行适应性进化分析，分支模型检测到3个可能存在的正选择分支、4个正选择位点以及 30个高度保守的位点；因此 psbA基因高度保守的特性得到验证。检测可能受到正选择的位点，为D1蛋白的结构和功能研究提供参考信息。基于UCL防子钟模型估算出耳叶苔科植物最早的分化发生在距今约121百万年前，

2、进入新生代分化速度明显加快，推测与被子植物的兴盛有关。关键词：耳叶苔科；psbA基因；分歧时间；适应性进化；正选择；Detection and analysis of psbA gene Frullaniaceae adaptiveevolution1210055113Tian Yi NingAbstract :D1 protein of the encoding gene is psbA.The D1 protein is one of the core subunits of the optical system II (PS II), which is involved in the m

3、aintenance of the stability and electron transfer of the PS II reaction center.In this paper, Frullaniaceae plant psbA gene sequence as the research object, using the branch site model, branch site model, and FEL model of psbA gene anal- lysisof adaptive evolution,The branching model was detected in

4、 3 possible positive selection clades, 4 positive selection sites, and 30 highly conserved loci;Thus the highly conserved properties of psbA genes were verified.The detection may be selected by the site, providing a reference forthe structure and function of the D1 protein.Based on the model of UCLD

5、 molecular clock estimate Frullaniaceae differentiation of the earliest plant occurred in about 121 million years ago, the new generation of differentiation into significantly faster, and that the prosperity of the angiosperms.Key words: Frullaniaceae; psbA gene; Divergence time; Adaptive evolution;

6、 Positive selection叶苔科Jungermaniaceae是苔类中较大科属之一，它建立于叶苔属 Jungermannia。从 Linne (1753)开始，至近期的 K. Mueller ( 19511956)和 Schuster ( 1969)等苔类学家 对本科的包括范围有较大的差异。已知本科植物中国有 8属82种。云南已知8属69种。耳叶苔科植物15个分类单位。植物体较多为革质或柔薄，颜色为紫色或暗绿色，有时略具光泽。 茎不规则分枝，或不规疏羽状分枝，长可达10厘米以上。D1蛋白不但可以与除草剂阿特拉津结合，而且在光抑制的条件下还会快速的更新，同 分子量为34ku的D2蛋白

7、质结合成复合物，在光电子的转运中起着重要的作用。植物中含有叶绿素，通过光合作用能高效的吸收、传递和转换光能。PS n反应中心是主要集中于内囊体膜垛叠基粒膜区的多亚基色素蛋白复合体，至少含有25种蛋白亚基。色素吸收光能后将一部分将水分子光解为氧和氢；而另一部分经过电子传递，最终使ADP与磷酸基（Pi）结合生成atp,为植物的生长发育带来直接的能量。光系统 n（ PS n）反应中心在这一过程 中起着至关重要的作用1,这主要涉及光能的转换、电子和质子的产生以及分子氧的释放 2。D1蛋白是ps n反应中心的两个核心蛋白之一,对维持ps n反应中心构象的稳定 、原初电荷的分离以及电子的传递至关重要网。p

8、sbA基因编码编码 D1蛋白；它不仅是编码PS n组分的14个叶绿体基因中被最先分离、克隆和鉴定的基因，而且也被研究得最多。这些研究大多数为 psbA基因的克隆、测序 、定位和序列结构、密码子使用特性、表达调控及D1蛋白的光抑制现象等方面4。在基因水平上对耳叶苔科植物的适应性进化进行分 析与检测，然后识别氨基酸的结构与功能位点，对于揭开生物进化的奥秘和加深对基因结构与生物变异的理解有着重要意义。鉴于psbA基因在光合作用中的重要作用和GenBank中已经收录的大量 psbA基因的全系列数据。所以本文以耳叶苔科植物的psbA基因进行适应性进化分析，目的在于： （1）通过估计耳叶苔科各物种间的分歧

9、时间，推测在其进化过程中起影响的因素。（2）检测psbA基因在进化过程中所受到的选择压力。然后推断D1蛋白在结构，功能和环境适应性方面发挥重要作用的位点，为D1蛋白的研究提供参考资料。1材料和方法 1.1序列数据 由GenBank获得耳口f苔科117种植物 以及外类群4种植物的psbA基因序列（表1）。使用 ClustalW软件进行序列比对并进行手工校正。使用 Clustal W 软件进行序列比对，在比对 后得到的数据矩阵中，每条序列包含有353个密码子，1059个核甘酸。根据Modeltest 3.7 34软件选取的最优核甘酸进化模型GTR+I+G设置似然模型参数。采用Mrbayes 3.1

10、.2 33软件经贝叶斯途径构建耳叶苔科的系统发育树。系统发育模型的后验概率依据 Mropolis-Hastings-Green算法通过 4 条链（Markov ChainMonte Carlo ,MCMC）运行15 000000代估计。利用Tracer v1.4.1软彳V5检验各参数的收敛程度， 取样大小（ESS, efficientsampling size） 值均大于500时,即可认为运算达到收敛。MCMC析以随机树起始，每100代保存1棵树，最初的37 500棵树被当作老化样本摒弃，剩余样本由 Figtree v1.2.3软件构建系统发育树。现代生物学的基础是进化论和遗传学。建立一组物种

11、上的进化树是进化生物学以及与此相关的遗传学、流行病学研究的基本手段7。通过系统发育分析推断或者评估进化关系，一般用分支图表（进化树）来表示。 1.2进化分析在位点模型、分支模型和分支-位点模型下采用位点间取不同3值的最大似然法模型（Maximum Likelihood Models ）。最大似然法是一种比较严格的参数估计方法，可以基于密码子替换模型检测不同位点承受的选择压力，尤其是氨基酸水平的正选择位点。分支-位点模型假定不同位点有不同的选择压力，而在系统树的不同分支上并无差异。本研究比较了 3对模型，即Mla（近中性）和M2a（选择）、M0（单一值率）和 M3（离散）以及 M7（beta）和

12、M8（beta 和3）,检测是否存在正选择位。通过度量核甘酸序列非同义替换率（dN）与同义替换率（dS）的比值（3）,可以判断自然选择对非同义替换的固定是起推动还是阻碍作用。当 dN/dS大于 1时，证明蛋白质发生有益的氨基酸替换，表现为正选择作用。表1 植物材料及其psbA因GenBank登录号Table 1 Plant materials and theirpsbA gene GenBank accession numbers中文名Chinese name学名Species nameGenebank登录号Accession number一Frullanoides mexicana Slag

13、eren.EF011851一Frullania aculeata TaylorFJ380698喙尖耳叶苔Frullania acutilobaMitt.FJ380572一Frullaniaaff. neurotaCosta & GradsteinFJ380637一Frullania amplicraniaSteph.FJ380599一FrullaniaampulliferaJ.B. Jack &Steph.FJ380561一Frullania anderssoniiAngstrom.FJ380558一Frullania angulata Mitt.FJ380703-Frullaniaanoma

14、la E.A. Hodgs.FJ380611一Frullania apicalisMitt.FJ380695尖叶耳叶苔Frullaniaapiculata (Reinw.,Blume&Nees) Dumort.FJ380681折扇耳叶苔Frullania arecae (Spreng.) GottscheFJ380624-Frullania armitiana Steph.FJ380676一Frullaniaaterrima (Hook.f. & Taylor) Gottsche, Lindenb. & NeesFJ380680一Frullania atrata(Sw.) Dumort.FJ3

15、80687-Frullaniaazorica Sim-Sim et al.FJ380586缅甸耳叶苔Frullania berthoumieuiiSteph.FJ380563细茎耳叶苔Frullania bolanderiAustin.FJ380671一Frullania brasiliensisRaddiFJ380700-Frullania brittoniaeA. Evans.FJ380592一Frullaniacalifornica(Austin ex Underw.) A. EvansFJ380658一Frullania cf. madothecoidesDavisAY607942一F

16、rullaniachevalieri(R.M. Schust.) R.M. Schust.FJ380616-Frullaniacongesta (Hook.f. & Taylor) Hook.f. & Taylor ex Gottsche et al.FJ380645一Frullania cuencensis TaylorFJ380636一Frullania deplanata Mitt.FJ380568-Frullania depressa Mitt.FJ380634一Frullaniadiptera (Lehm.) Gottsche, Lindenb. & NeesFJ380570一Fru

17、llania duthiana Steph.FJ380593一Frullania eboracensis GottscheAY688827-Frullaniaeboracensis subsp. Parvistipula(Steph.) R.M.Schust.FJ380588一Frullania ecklonii(Spreng.) Spreng.FJ380622皱叶耳叶苔Frullaniaericoides (Nees ex Mart.) Mont.FJ380550波叶耳叶苔Frullania eymae S. Hatt.FJ380562一Frullaniafalciloba Taylor e

18、x Lehm.FJ380544一Frullaniafengyangshanensis R.L. Zhu & M.L. SoFJ380596一Frullania ferdinandi-muelleriSteph.FJ380575-Frullaniafragilifolia(Taylor) Gottsche, Lindenb. & NeesFJ380667一Frullaniafugax (Hook.f. & Taylor) Gottsche, Lindenb. & NeesFJ380609一Frullania fulfordiaeS.Hatt.FJ380608暗绿耳叶苔芽胞变Frullaniafu

19、scovirens var. gemmipara(R.M.Schust. &S.Hatt.)FJ380590种S.Hatt. &P.J.Lin短瓣耳叶苔Frullaniagaudichaudii(Nees& Mont.) Nees& Mont.(I )FJ380665-Frullania gibbosa NeesFJ380638一Frullaniaglomerata (Lehm. &Lindenb.) Nees& Mont.FJ380613一Frullaniagracilis(Reinw., Blume&Nees) Dumort.FJ380674一Frullania grossiclavaSt

20、eph.FJ380656一Frullaniahamata Steph.FJ380651一Frullaniahattoriivon Konrat&BragginsFJ380678-Frullaniaholostipula S.Hatt. & D.G. GriffinFJ380627一Frullaniahoweana Steph.FJ380559细瓣耳叶苔Frullaniahypoleuca NeesFJ380639-Frullaniaincumbens Mitt.FJ380610石生耳叶苔FrullaniainflataGottscheFJ380670-Frullaniaintermedia (

21、Reinw.,Blume&Nees) Dumort.FJ380652-Frullaniaintumescens (Lehm. &Lindenb.) Lehm. & Lindenb.FJ380690-FrullaniajackiiGottscheFJ380595-Frullaniakunzei Lehm. & Lindenb.FJ380697-Frullanialobulata (Hook.) Dumort.FJ380619-Frullaniamagellanica F.Weber&NeesFJ380618-Frullaniameyeniana Lindenb.FJ380693-Frullani

22、amicrocaulisGolaFJ380620-Frullaniamicrophylla (Gottsche) PearsonFJ380668-Frullaniamirabilis J.B.Jack&Steph.FJ380685列胞耳叶苔Frullaniamoniliata (Reinw., Blume&Nees) Mont.AY507484-Frullaniamonocera (Taylor) Gottsche, Lindenb. & NeesFJ380574-Frullaniamoritziana Lindenb. & GottscheFJ380691-Frullaniamultilac

23、eraSteph.FJ380673尼泊尔耳叶苔Frullanianepalensis (Spreng.) Lehm. &Lindenb.FJ380580厚角耳叶苔Frullanianodulosa (Reinw., Nees&Blume) NeesFJ380650-Frullaniaobcordata Lehm. & Lindenb.FJ380641-FrullaniaobscurifoliaMitt.FJ380604-Frullaniapatula Mitt.FJ380567-Frullaniaperuviana GottscheFJ380704-FrullaniapittieriSteph

24、.FJ380692-Frullaniaplana Sull.FJ380583-FrullaniapolystictaGottsche, Lindenb. &NeesFJ380660-Frullaniaptychantha Mont.FJ380644-Frullaniapurpurea Steph.FJ380672-FrullaniareflexistipulaSande Lac.FJ380573-Frullaniaregularis SchiffnerFJ380654-FrullaniarepandistipulaSande Lac.FJ380646-Frullaniareptans Mitt

25、.FJ380603褶瓣耳叶苔Frullaniariojaneirensis(Raddi) SpruceFJ380628-Frullaniariparia Hampe ex Lehm.FJ380598一Frullaniarostrata (Hook.f. & Taylor) Gottsche, Lindenb. &FJ380615Nees齿叶耳叶苔Frullaniaserrata GottscheFJ380683一Frullaniasheana S.Hatt.FJ380675一Frullaniasolanderiana ColensoFJ380614一Frullaniasp. Pocs & Po

26、csFJ380679一Frullaniasphaerocephala SpruceFJ380621Frullaniaspinifera TaylorFJ380560-FrullaniaspinigastriaS.Hatt.FJ380566一Frullaniasquarrosula (Hook.f. & Taylor) Hook.f. & Taylor exFJ380547Gottsche et al.-Frullaniasubcaduca S.Hatt.FJ380597-Frullaniasubdentata Steph.FJ380682-Frullaniasubincumbens S.Hat

27、t.FJ380605-Frullaniasubnigricaulisvar.subtruncataS.HattFJ380565-Frullaniasubrostrata S.Hatt.FJ380677欧耳叶苔Frullania tamarisci(L.) Dumort.AM396284-Frullaniatamarisci subsp. asagrayana(Mont.) S.Hatt.FJ380657-Frul laniatamarisci subsp. Nisquallensis(Sull.) S.Hatt.FJ380661塔拉大克耳叶苔Frullaniataradakensis Step

28、h.FJ380591-FrullaniatetrapteraNees & Mont.FJ380633-Frullaniatrinervis(Lehm.) Lehm. &Lindenb.FJ380647-Frullaniausamiensis StephFJ380589-Jubula bogotensis Steph.AM396281毛耳苔Jubulahutchinsiae subsp. javanica(Steph.) Verd.AY507492-Jubulahutchinsiae subsp. pennsylvanica(Steph.) Verd.AY607954-Lejeuneacance

29、llata Nees& Mont. ex Mont.EF011810-Lejeuneacavifolia (Ehrh.) Lindb. Emend. BuchAM396279-Lejeuneacerina voucher Wilson et al.EF011820-Lejeunea cladogyna EvansAY607958-Lejeunea flava (Sw.) NeesEF011789-Lejeunea pallescens Mitt.EF011772-Lejeunea paucidentata (Steph.) GrolleEF011826-Nipponolejeunea pili

30、feraAM396291-Nipponolejeunea subalpinaAM3962902结果2.1耳叶苔科的系统发育和分化时间利用贝叶斯法重建了耳叶苔科psbA基因的谱系关系（图1）。从图中可以看出，耳叶苔科明显可分为两大支（后验概率为1.00）。第一支由毛耳苔属和日鳞苔属组成，第二支由毛耳苔属和所有耳叶苔科的物种组成。其中Jubulahutchinsiaesubsp.pennsylvanica （Steph.）Verd.处于基部位置。为准确估计耳叶苔科各支系的分歧时间，本研究采用 JochenHeinrichs等25报道的日鳞苔科与耳叶苔科的分歧时间进行单点校正。分析结果表明，耳叶苔科

31、第一 次分化发生在约121百万年前，分化速度在进入新生代之后明显加快，分析可能是与白垩纪被子植物的兴盛以及古新世-始新世最热地质事件有关。ISfl-fl175. C100 Q 75M50.025. 00 Q 位！ IhO图1基于耳叶苔科 psbA基因序列数据和 UCLD分子钟模型构建的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of Frullaniaceaeestablished from psbA gene sequences with uncorrelated lognormal distributed relaxed clock mode2.2正向选择氨基酸位点的

32、鉴定根据耳叶苔科植物的psbA基因数据集，所求得了不同模型相应的参数估计值和对数似然值（表2）。在位点模型下，模型M2a（选择）、M3（离散）及M8（beta和 ）的假定条件中均允许 3比值大于1,分析结果表明psbA基因中存在受到正选择的位点（表2）。而在分支模型与分支-位点模型的假定条件中，并没有存在正向选择的氨基酸位点。与它们各自对 应的空模型 M1a（近中性）、M0（单一比值）及M7（beta）相比，这些模型更符合所分析的数据（表3）。例如：M1a与M2a相比则少了两个参数， 它们的LRT统计量2A ?18.031330, 明显大于当d.f=2、p =5%时的x2分布临界值 5.99。

33、在95%勺水平上，M2a模型、M3 （离散） 模型和M8 （beta & co）检测出了受到正选择的氨基酸位点。表2各类位点间可变 3比值模型下的参数估计值和对数似然值Table 2 Parameter estimates and log-likelihood values under models of variable w ratiosamong sites模型似然值?Estimated value of parametersPositive selection sitesModelsnpM0 （单一比值）M0 : One ratio175-3985.5068923 = 0.02650无

34、NoneM1a （近中性）M1a: Near neutral176-3933.082580p0=0.97603, a 0=0.02397P1=0.00810, 3 1=1.00000不允许Not allowed位点模 型SitemodelsM2a （选择）M2a :Positiveselection178-3924.066915p0=0.97656, P1=0.02060, P2=0.00284a 0=0.00844, a 1=1.000003 2=6.08838p0=0.92026,p1=0.07690,155 T*M3 （离散）M3 : Discrete179-3907.386458p2=

35、0.00284co 0=0.00000 co 1=0.236033 2=5.74112155 T*M7 （beta）M7 ： beta176-3928.684116p=0.00500, q=0.10114不允许Not allowedM8 （beta & aM8: beta & 178-3907.890409p0=0.99716 , p=0.01082 , q=0.26453, p1=0.00284 , w=5.74080155 T*分支模one-ratio175-3985.5068923 = 0.02650无 None型Branchmodels自由比率（free-ratio）347-3925.

36、532334wA=999.0000,coB=999.0000 , coC=999.0000无 None分 支a零假设A0-3929.967965Null model A0177备选假设AAlternative178-3929.756434model A分支-位 点模型分 支 b零假设B0Null model B0177-3932.680023Branchsite备选假设BmodelsAlternative178-3932.680023model B分 支c零假设C0Null model C0177-3929.970251备选假设CAlternative178-3929.759060model

37、Cp0=0.00000, p1=0.00000, p2a+p2b=1.00000,3 0=0.00812 3 1 =1.00000 , 3 2 = .00000p0= 0.00000 , p1=0.00000, p2a+p2b=1.00000,3 0=).00812, co 1=.00000,3 2:84.33969p0=0.97597, p1=0.02403 , p2a+p2b=0.00000,co 0=0.00811, CO 1=1.000003 2=1.00000p0=0.97596, p1=0.02404 , p2a+p2b=0.00000,3 0=).00811, co 1=.000

38、00,3 2=.00000p0=0.00000, p1=0.00000 , p2a+p2b=1.00000,co 0=0.00812 co 1 = .00000, 3 2=.00000p0=0.00000, p1=0.00000 , p2a+p2b=1.00000,3 0=).00812, co 1=.00000,不允许Not allowed19 N (0.755)不允许Not allowed无 None不允许Not allowed19N (0.873)CO 2=96.21039此外，位点模型所监测到psbA基因大量负选择位点，模型 M0由序列数据估计得各位点的平均值为0.0265 ,表明在p

39、sbA基因的进化过程中净化选择起着主导作用。模型M2a和M8均允许位点受到正选择作用，在统计上也显著优于它们各自对应的空模型M1a和M7。模型M2a的结果显示psbA基因中有97.7%的位点受到负选择的作用( 3=0.00844)。同时 模型M8也检测到99.7%的位点处于负选择压力下。所有的分析如图3为耳叶苔科psbA基因在Datamonkey中的分析结果均支持耳叶苔科 psbA基因在进化上保持高度的保守性。表3似然比值检验统计量(2A?)Talbe3 Likelihood ratio statistics (2 ?) A模型比较2A ?自由度2Comparion2A ?d.f.x5%位点模

40、型Site modeM0 vs. M3156.24086849.49M1a vs. M2a18.03133025.99M7 vs. M841.58741425.99M8 vs. M8a22.24697613.84分支模型Branch modelM0 vs. F 分支-位点模型 Branch-site model119.949116172206.87A0 vs. A0.42306213.84B0 vs. B0.00000013.84C0 vs. C0.42238213.84.注：np表示模型中参数的数目；“*”和“*”分别表示在95%和99%水平上检测到的正选择位点。Note: np stand

41、s for the number of parameters in different models. * and * stand for the positively selected sited were founded under 95% and 99% credible level, respectively.B图3耳叶苔特 psbA基因在 Datamonkey中的分析结果A:Datamonkey检测到的正负选择位点数；B: 30个高度保守位点的dN以及dS值Figure 3 The Datamonkey analysis result for the psbA gene of Fru

42、llaniaceaeA: The numbers of negatively and positively selected sites in Datamonkey; B: The dN and dS values of 30 highly conserved sites.序列变异程度分析图2为耳叶苔科D1蛋白各位点的嫡值图。在嫡值为零的情况下，表示该位点高度保守并未 发生变异。嫡值越大，则表明变异程度越高。从图可以明显看出，耳叶苔科 psbA基因大多 数的蛋白位点都属于高度保守位点，只有少数位点在进化过程中发生变异。只有3I和15I变异度较高（嫡值为0.6到0.7之间）。1431331931

43、131031921821721621521421321221121021QW11811711611511411311211O1 19 18 17 16 15 14 13 12正负选择位点的定位图4为psbA基因编码D1蛋白三维结构以及正选择位点的空间位置，正选择位点115T,203I位于分别定位于跨膜a -螺旋 B和D上。另外两个正选择位点位于区域（图5）130E,210l,260F,340P,350V 等。图2耳叶苔科D1蛋白各位点的嫡值图Fifure2 Entropy plot for amino acid residues in D1 protein of Frullaniaceae图4

44、 psbA基因编码D1蛋白三维结构以及正选择位点的空间位置（基质侧在上，类囊体腔侧在下）Figure 4 The 3-D structure of D1 protein encoded by psbA gene and the position for thepositively selected sites(Thecytoplasmicsideison top,thelumenal side on the bottom).Lcrj ouno4_pall0SQns QonaoTLsuH102 白3040500 | | | | + N - - I + * * IMTAXXERRf S AS IW

45、 EUTMW ITS ITiiRXil ! WT VU 1 1工工-：L 号，工】J l UWr VPIA*t ft -* t* Bi *JLeJ etinea pa-llesoeELECliiet al O(m看总 口；？口分70go901 口口UD1Qj ( i 1，)(I ! I1 |iaraB|D IM；卫廿- EJLi(T24i4IlXUAilPlAjitOltbWtLMMG 3tLtllVXHi LA 4 4 A A I * A,1 *,*,+#*# A 4 ; 4 A 11 A AXe)归un暂逐 pm BsueLLfi：CXlL t aX 1con巨上L后 Li13010L 知

46、1 的LTD1前 H - - | 一 H 8 .- - - - a - 8 U I - 1 I 一 - S VMTH)&他 WTSFEULGMR PWHWZSAP 1raMlIHEL工 TPIGn SFSD 3*31写GTE昌事占看量能能#+* 昌4/*青#*：*+ 昌尚修长涓RCLttJ y in w_gj11uhub ClllMt dl CbUJJWmLtf UM1902002J02 EO230艺典;! |Ji r ar| , i | 1 l-Bavrl b1 ! |rMmXUkllf IIIIMII -!(ML VI VB sL 1MH S1,V1 SSXISLETTTJff ESUIA

47、i, H-d pd 1 *Xxn* cl ns r nil cons en弊纥43LC320330303SD 3I I| 一” 一 IlFSQ5TnrBiSQ RVTSITWftBT TKEJ4nMKM HtTKltN HMrp I D1.A/VEAPV O - * &#*4 *i ft A A # A * 4 A *、)、昌昌* 局昌#: 朝 士，图5 psbA基因编码D1蛋白比对结果（用红色阴影标出部分表示五处跨膜结构域，分别用A、B、C、D、E表示）。Figure 5 The alignment result for D1 protein encoded by psbA gene(Fivetransmembrane regions a