《细胞生物学》课件4细胞生物学的研究方法

1、细胞生物学研究方法第四部分内容提要经典技术-显微及亚显微结构的观察（现代分子细胞生物学技术 ）细胞组分的分离和分析（细胞生物学与其他学科交叉的技术）细胞培养、细胞工程等相关技术（现代分子细胞生物学技术 ）一、 细胞形态结构的观察方法显微镜的出现，结合细胞化学的方法，尤其是免疫细胞化学技术，细胞整体形态、细胞的结构、细胞中的分子甚至原子都得以揭示。Figure 3-1. Resolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects

2、 that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes. 肉眼：0.2 mm; 光镜：0.2 um; 电镜：0.2 nm（一）、光学显微镜技术：光学显微镜技术是细胞生物学研究常用手段之一。光学显微镜构成： 光学放大系统（包括物镜和目镜） 照明系统 支撑系统1 复式光学显微镜技术显微镜最为重要的性能参数是分辨率（指区分开两个质点间的最小距离），而非放大倍数。性能参数：D值越小，分辨率越高（D值与光源波长成正比，与介质折射率N成反比； 所以波长越短，分辨率越高，介质折射率越大，

3、分辨率越高） 0.61 N sin（/2）分辨率 D=以波长最短的可见光（400-700nm）的蓝光（450nm）为光源，空气为折射介质，光学显微镜最大分辨率0.3um ；以油为折射介质，可以达到0.2um；如果以紫外线（200-300nm）作为光源，分辨率可达到0.1um。 光镜下可以看到的结构包括细菌、线粒体（0.5um大小，是光镜下能清晰可见的最小物体）、中心体、核仁等，称为显微结构。组织切片的制备取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察固定的目的是使细胞及其成分锁定在原有的位置，常用的有乙醇、甲醇、甲醛、戊二醛等。常用的染色剂有苏木精、伊红、孔雀绿、苏丹黑、考马斯亮蓝等，它们对

4、细胞某一特殊的亚细胞成分有特异的亲和性。切片厚度1-10um有丝分裂中期固定的洋葱根尖细胞中，福尔根染色的结果，特异显示DNA使用明视野显微镜（bright-field microscope）很难观察到小的、未经染色的样品，如：活细胞。相差显微镜（phase-contrast microscope）则易于观察高透明的物体。2 相差和微分干涉显微镜技术相差显微镜：利用光的衍射现象，通过增加相差板和环形光阑，将肉眼不能察觉的相位差转变成振幅差，从而表现为肉眼可见的明暗区别。 样品不需要染色，优点是能观察无色、透明的活细胞中的结构。利用的是不同成分、部分的光衍射系数不同的特点。细胞培养中使用的倒置相

5、差显微镜，更便于观察培养物中的活细胞。倒置显微镜：适合直接观察培养的细胞结构上物镜和照明系统颠倒，光源来自上方，物镜在载物台的下方。倒置显微镜观察培养皿表面生长的小鼠细胞微分干涉显微镜：微分干涉反差（DIC）也叫做Normarski干涉，在相差显微镜原理的基础上发明的，与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故可以产生三维效果更强的影像。利用光的干涉现象，以平面偏振光为光源，将厚度差转变为明暗差，适合观察活细胞中较大的细胞器。微分干涉相差显微镜拍摄的毛口虫暗视野显微镜： 利用丁达尔光学效应的原理。 聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，

6、因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。主要观察物体的轮廓，不能分辨内部的微细结构，适于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。暗视野显微镜拍摄的变形虫 Fig. Four types of light microscopy. (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy. (B) phase-contrast microscop

7、y, (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D) dark-field microscopy（暗视野显微镜）. 使用不同类型的光学显微镜观察到的细胞的比较(a) 明场(b) 相差(c) 微分干涉反差（DIC）Video-enhance(contrast) microscopy（录像增差显微镜） 将计算机辅助系统应用于微分干涉显微镜，观察和记录活细胞中颗粒及细胞器的运动。3 荧光显微镜技术荧光显微镜的原理是利用一定波长的紫外线作为光源来激发标本中存在的荧光物质，使其发出不同颜色的光而成像。是目前光镜水平对

8、蛋白等大分子定性定位研究的重要工具。包括两套滤光片，激发光滤片（只让能激发特殊荧光染料的波长通过）和阻断滤片（只允许荧光通过），在黑暗的背景上，发出荧光的样品很容易被观察到。荧光显微镜有些生物体中的天然物质受到紫外线照射能够发出荧光，有些成分则不发光或荧光微弱，需要特定的荧光染料染色显示。常用荧光染料： DAPI(联脒基苯吲哚)和碘化丙锭可以染DNA； 吖啶橙可以染DNA和RNA； 荧光黄（fluorescein）受到蓝光激发产生强烈的绿色荧光；罗丹明（rhodamine）受到黄绿色光激发可产生深红色荧光，分别与抗体耦联，可以观察两种不同抗原分子在同一细胞内的分布。Rat aortic smo

9、oth muscle cells are labeled with the same dyes as the CHO cells. The nuclear DNA is stained by Hoechst (blue), the mitochondria stained by MitoTracker (green), and the filamentous actin stained by BODIPY TR-X phallacidin (red). 绿色荧光染料标记的微管抗体特异性结合纺锤体，蓝色是即将分离进入两个子细胞的染色体 成纤维细胞固定后用荧光抗体进行染色的显微照片展示线粒体（绿色

10、）和细胞骨架的微管（红色）在细胞中的分布在细胞生物学与分子生物学领域中，来自水母的绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报告基因(reporter gene)。 将GFP基因与待测基因融合，在细胞内表达，可以通过荧光显微镜观察蛋白在活细胞内动态变化。活的果蝇胚胎的荧光显微照片，胚胎细胞表达由GFP和一种驱动蛋白相关的马达分子组成的融合蛋白。GFP蛋白的位置显示蛋白是胚胎细胞有丝分裂纺锤体和中心体的一部分。 日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而获得2008年诺贝尔化学奖。 4 激光扫描共焦显微镜技术20世纪50年代后期发明，多技术的集合。物

11、镜和聚光镜同时聚焦到同一点上（共焦点），可以自动改变观察的焦平面，通过“光学切片”获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后重构样品的三维结构。比普通荧光显微镜成像更清晰，分辨率更高。在研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化应用广泛。共聚焦显微镜及其显微图像Figure 3-8. Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stai

12、ned with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell

13、 in the embryo. 共聚焦显微镜拍摄的紫茉莉花的雄蕊5 荧光共振能量转移技术（现代分子细胞生物学技术之一，用于蛋白质相互作用的鉴定）检测活细胞中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有利工具，可以检测两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。荧光共振能量转移检测系统方法是将两种蛋白分别与CFP（ cyan fluorescent protein）,YFP（ yellow fluorescent protein ）融合表达，通过检测CFP荧光强度的损失量确定两个蛋白是否相互作用。如果发生能量转移，说明两个蛋白的距离在10nm的范围内，一般可以认定有相互作用。6 荧光漂白恢复技术（现代分子

14、细胞生物学技术之一，用于生物膜组分的动力学研究）荧光光漂白（FRAP）技术可进行生物膜脂质分子侧向扩散的研究，胞间通讯的研究，胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等。 利用荧光分子的耦联，检测活细胞表面或内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。能够获得蛋白质运动的定性结果，还可以得到扩散常数、蛋白移动率等定量信息。FRAP结果可以说明任何类型的荧光分子运动情况，例如：是被动的还是主动的。恢复时间则表明了运动的速度。 蓝色：无关细胞对照组 绿色：同一细胞对照组 红色：光漂白组（二）、电子显微镜技术分辨率更高，1932年Ruska制成。与光镜的基本区别：构成上：光源为电子束（小于0.1

15、nm），使用电磁透镜，镜筒中要求高真空，图像通过荧光屏观察。分辨率上：最高0.2nm，只能在电子显微镜下观察到的结构称为亚显微结构（超微结构）。实际放大倍数为4500倍时，由光镜和电镜拍摄的图像中所含信息的比较（a）1um厚的骨骼肌组织在光镜油镜下拍摄的图片（b）0.025um厚的同样组织切片在相同倍数的电镜下观察的结果，分辨率增加1-200倍透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM） 利用透过样品的电子形成图像，在观察细胞内部结构方面应用广泛。扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM） 利用样品表面反弹

16、的电子成像，主要用于观察物体的表面结构。透射电镜及其图像1 透射电子显微镜 放大倍数在1000-250000倍之间，分辨极限为35埃。 TEM电镜制样技术：(1)超薄切片技术:厚度40-50nm 固定包埋切片染色 Figure 3-19. Diagram of the copper grid used to support the thin sections of a specimen in the transmission electron microscope. Thin sectionsFigure 3-20. Electron micrograph of a root-tip cell

17、 stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. Figure 3-21. Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme (nucleotide diphosphatase) in the Golgi appar

18、atus. A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electron-dense precipitate upon reaction with the enzymeFigure 3-63. Immunogold electron microscopy. Electron micrographs of an insulin-secreting cell in which the insulin molecules have been labeled with anti-insulin ant

19、ibodies bound to tiny colloidal gold spheres. Most of the insulin is stored in the dense cores of secretory vesicles; in addition, some cores are being degraded in lysosomes.免疫电镜技术(2) 冷冻超薄切片技术可以保存可溶性物质和生物大分子的活性（尤其是酶），能够在分子水平上研究细胞的超薄结构。 样品放置在液态丙烷（-42）或液氦（-273 ）冷却的金属块上，快速冷冻，冰晶没有时间生长到明显破坏细胞结构的程度。 冷冻切片制

20、备快速，在临床上用于切除组织的恶性或良性的鉴定。(3) 冷冻蚀刻电镜技术 通过样品迅速冷冻和低温下断裂，观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。样品可不经包埋和固定处理。冷冻断裂复型形成的过程断裂蚀刻投影和复型氟利昂从正上方垂直在金属层上沉积碳在断裂面上沉积重金属Figure. Freeze-fracture electron micrograph of the thylakoid membranes from the chloroplast of a plant cell. These membranes, which carry out photosynthesis, are stacked

21、 up in multiple layers. The largest particles seen in the membrane are the complete photosystem II-a complex of multiple proteins. Freeze-Fracture and Freeze-Etch Electron Microscopy 图 18.10 深度蚀刻。原生动物四膜虫纤毛轴丝的电镜照片。（4）负染色技术： 负染色是用重金属，如磷钨酸或醋酸双氧铀，对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品经自然干燥后，整个载网上都铺上了一层重金属盐，从而衬托出样品的精细

22、结构。投影的原理金属沉积在面对金属丝的颗粒表面，颗粒背面和阴影部分则没有。电镜下观察投影部分表现亮，被金属覆盖的部分则暗。样品具有极好的反差，产生三维图像效果铂丝蒸发真空容器样品架观察分离颗粒的另一种技术是使物体形成投影图 18.8 负染色和金属投影样品的例子（a）以磷钨酸钾负染色后的烟草脆裂病毒的电镜照片（b）用铬投影的电镜照片2 扫描电子显微镜：主要观察样品表面的形貌特征。制样不需要切片和染色。为防止样品在干燥中变形，常用CO2临界点干燥法，样品观察前要用镀金（一般是金或金-钯合金）的方法使标本导电。观察样品的大小范围从病毒到昆虫的头部，一般放大为15-150000倍，分辨率3nm。扫描电

23、镜及其图像Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microsco

24、py (C). Figure 3-32. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.图 18.11 扫描电镜技术。（a）T4噬菌体（x275 000）（b）昆虫头部（x40）的扫描电镜照片3 扫描隧道显微镜 （scanning tunnel microscpoe,STM） 1986年获诺贝尔物理学奖，用于观察大分子、生物膜和病毒等，在纳米水平探索微观世界物质表面形貌。扫描隧道显微镜纳米团簇“溴原

25、子” 二、细胞组分的分析方法 细胞的分离技术：分离特定类型细胞 亚细胞组分的分离技术：分离特定的细胞器或组分 细胞化学技术：显示鉴定大分子 免疫细胞化学技术：特异蛋白的定位和定性 原位杂交技术：特定核酸序列的定位和定性 放射自显影技术：标记的生物大分子定位、定量以及大分子动态示踪1 细胞的分离技术：（1）流式细胞技术（flow cytometer,FCM）： 从组织中分选相对纯化细胞的方法，利用了荧光染料耦联的抗体标记细胞，通过FCM分选已标记和未标记的细胞，依据的是细胞内发荧光的DNA含量不同，或者细胞表面荧光强度不同的特点。 该技术广泛用于生物大分子的定量，细胞周期分析，细胞表面抗原、受体

26、、染色体、核质比例、活细胞分类纯化等研究中。Figure 3-31. A fluorescence-activated cell sorter. When a cell passes through the laser beam, it is monitored for fluorescence. Droplets containing single cells are given a negative or positive charge, depending on whether the cell is fluorescent or not. The droplets are then d

27、eflected by an electric field into collection tubes according to their charge. Note that the cell concentration must be adjusted so that most droplets contain no cells and flow to a waste container together with any cell clumps. The same apparatus can also be used to separate fluorescently labeled c

28、hromosomes from one another, providing valuable starting material for the isolation and mapping of genes. （2 ）密度梯度离心法分离细胞： 通过离心溶液形成密度梯度，以维持重力的稳定性来抑制对流。 密度梯度离心纯化：介质由连续的密度梯度组成，各种颗粒到达与自身密度一致的区域，形成一条区带。2 亚细胞组分的分离技术：通常是用低渗、超声、研磨、匀浆或冻融的方法将细胞裂解，然后通过差速离心（differential centrifugation）使各种亚组分分开。不同组分的沉降率依据大小和形状的

29、不同，以沉降系数(S)表示。 The technique of differential centrifugationStep-by-step procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.S=(dx/dt)/2x =110-13sec.Figure 3-35. Cell fractionation by centrifugation. Repeated centrifugation at progressively higher speeds will fractionate homog

30、enates of cells into their components. In general, the smaller the subcellular component, the greater is the centrifugal force required to sediment it. Typical values for the various centrifugation steps referred to in the figure are low speed: 1,000 times gravity for 10 minutes medium speed: 20,000

31、 times gravity for 20 minutes high speed: 80,000 times gravity for 1 hour very high speed: 150,000 times gravity for 3 hours 通过密度梯度离心，可以将分子量小的核酸或蛋白质进一步分离纯化出来。密度梯度离心常用的介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯。 速度沉降：分离密度相近大小不同的组分 等密度沉降：分离不同密度的细胞组分，更灵敏 例如：15N标记大肠杆菌DNA，用氯化铯密度梯度离心的方法直接证明了DNA的半保留复制。速率沉降分离不同大小的DNA分子50000rpm，5h根据碱基组成

32、差异用平衡沉降法分离DNA分子分级分离b所得到的管中的内含物密度梯度离心的流程3 细胞化学技术基于细胞内的某些成分可以和某些化学试剂相结合或呈特殊反应，在细胞内或表面形成有色沉淀物或结合物而显示细胞的结构和成分。DNA的显示：Feulgen反应多糖的显示：过碘酸雪夫（PAS）反应脂类的显示：四氧化锇或苏丹III酶的显示：通常将新鲜标本采用快速冷冻切片， 尽可能保持其活性，然后将样品与相应底物进行共孵育。不同的酶有不同的显示方法。4 免疫细胞化学技术在细胞水平研究特定的蛋白质的定位和定性，利用抗体的抗原特异性识别结合细胞内特定的蛋白质，再通过第二抗体的结合，使信号加强。最为敏感的增强信号的方法是

33、用结合于第二抗体的酶作为标记分子。例如：荧光染料用于荧光显微镜（免疫荧光技术）、辣根过氧化物酶用于光镜或电镜、胶体金颗粒用于电镜（免疫电镜技术）、碱性磷酸酶用于生化检测。临床上的利用酶联免疫吸附试验（ELISA）的敏感性可以检测妊娠或各种感染。Figure 3-64. Indirect immunocytochemistry. The method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The seconda

34、ry antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly used marker molecules include fluorescein or rhodamine dyes, the enzyme horseradish peroxidase or colloidal gold spheres, and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase. Figure 3-57. Visualizing int

35、racellular Ca2+ concentrations using a fluorescent indicator. The branching tree of dendrites of the Purkinje cell in the cerebellum receives more than 100,000 synapses from other neurons. The output from the cell is conveyed along the single axon seen leaving the cell body at the bottom of the pict

36、ure. This image of the intracellular calcium concentration in a single Purkinje cell was taken using a low-light camera and the Ca2+-sensitive fluorescent indictor fura-2. The concentration of free Ca2+ is represented by different colors, red being the highest and blue the lowest. (Courtesy of D.W.

37、Tank et al.) Figure 3-58. Fluorescent analogue cytochemistry. Fluorescence micrograph of the leading edge of a living fibroblast that has been injected with rhodamine-labeled tubulin. The microtubules throughout the cell have incorporated the labeled tubulin molecules. Thus individual microtubules c

38、an be detected and their dynamic behavior followed using computer-enhanced imaging, as shown here. Although the microtubules appear to be about 0.25 m thick, this is an optical effect; they are, in reality, only one-tenth this diameter. (Courtesy of P. Sammeh and G. Borisy.)5 原位杂交技术原位杂交（in situ hybr

39、idization）是采用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体或细胞中位置的方法。首先在光镜水平上发展起来，又出现了荧光原位杂交（荧光素标记探针在荧光显微镜下观察）、电镜原位杂交（生物素等小分子标记探针，通过检测抗生物素抗体相连的胶体金颗粒显示出来）。Figure 7-20. In situ hybridization for RNA localization in tissues. Autoradiograph of a section of a very young Drosophila embryo that has been subjected to in situ h

40、ybridization using a radioactive DNA probe complementary to a gene involved in segment development. The probe has hybridized to RNA in the embryo, and the pattern of autoradiographic silver grains reveals that the RNA made by the gene (ftz) is localized in alternating stripes across the embryo that

41、are three or four cells wide. At this stage of development (cellular blastoderm), the embryo contains about 6000 cells. (E. Hafen et al, Cell 37:833-841, 1984.) Tracing and Assaying Molecules Inside Cells6 放射自显影技术利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的细胞化学技术，能够对生物大分子进行动态研究和追踪。主要步骤：同位素标记的生物大分子前

42、体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。 3H-TdR研究DNA; 3H-U研究RNA; 35S标记Met和Cys，研究蛋白质将脉冲示踪实验和放射自显影术结合，对阐明细胞中的过程，例如分泌蛋白从内质网到细胞外的过程十分有效。 脉冲示踪是将放射性物质以脉冲形式加入样品，经极短暂处理后，将其洗去，以非放射性分子代替。将染色体制作技术和放射自显影技术结合，可以观察染色体复制的动态变化、细胞周期的测定、鉴别早复制或晚复制的染色体。 放射自显影的操作程序标记培养固定脱水包埋切片放射性敏感的液态乳胶暗盒储存显影Figure 3-51. Electron-microscopic autoradiography

43、. The results of a pulse-chase experiment in which pancreatic beta cells were fed 3H-leucine for 5 minutes followed by excess unlabeled leucine (the chase). The amino acid is largely incorporated into insulin, which is destined for secretion. After a 10-minute chase the labeled protein has moved fro

44、m the rough ER to the Golgi stacks (A), where its position is revealed by the black silver grains in the photographic emulsion. After a further 45-minute chase the labeled protein is found in electron-dense secretory granules (B).(Courtesy of L. Orci, from Diabetes 31:538-565) 光学显微镜和电子显微镜放射自显影（a）摇蚊属

45、昆虫多线染色体的光学显微镜放射自显影照片，显示了在染色体的膨大区，大量的3H尿嘧啶核苷插入RNA中。（b）骨髓细胞电子显微镜放射自显影照片。箭头指出黑色银颗粒显示了硫酸盐掺入到高尔基复合体的部位。三、细胞培养、细胞工程等相关技术（一）、细胞培养： 属于生命科学研究的基本实验技术，涉及： 原核细胞培养（细菌） 真核单细胞培养（酵母） 动物细胞培养 植物细胞培养细胞培养的用途广泛，不仅可以研究细胞本身的生物学特性，还可改变培养条件、用特殊的理化因子和生物因子处理，观察细胞在形态、结构、行为、甚至基因的变化，从而得到细胞生长、分化、癌变、凋亡、衰老以及其他的病变规律。1 动物细胞培养任何动物细胞的培

46、养都需从机体获取细胞开始，因此体外培养细胞包括：（1）原代细胞（primary culture cell） 从机体取出后立即培养的细胞，不同类型的细胞体外培养的难度差别很大。 取材分散细胞（酶消化处理和细胞筛滤过）-制备单细胞悬液-提供合适的培养环境（营养、温度、pH、血清、CO2等）-细胞贴壁进行有丝分裂形成细胞单层(2)传代细胞（subculture cell） 适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞。 包括两种类型： 有限细胞系（finite cell line）： 体外培养传代次数有限的细胞（约50代）。 永生细胞系（infinite cell line）： 传代中发生遗传突变，具有了

47、癌细胞的特点，有可能无限制的传代培养下去。体外培养细胞可以分成贴壁型和悬浮型，一般不能保持体内原有的细胞形态。贴壁型有两种基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞；悬浮型则呈球形。2 植物细胞培养（1）单倍体细胞培养： 花药离体培养： 雄性生殖细胞-胚状体-单倍体植株 愈伤组织培养： 诱导愈伤组织-分化出芽和根-完整植株（2）原生质体培养： 植物体细胞-纤维素酶消化细胞壁-原生质体-培养和诱导分化-植株（二）、细胞工程： 在细胞水平的生物工程，涉及的技术包括： 细胞培养 细胞分化的定向诱导 细胞融合 显微注射1 细胞融合与细胞杂交技术： 细胞融合： 两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞，不经有性生

48、殖过程而得到杂种细胞的方法。 方法： 病毒介导（灭活的仙台病毒） 化学介导（聚乙二醇） 电融合（高压电脉冲）基因型不同的细胞形成的融合细胞叫做异核融合细胞，在培养过程中会发生染色体丢失，例如：人鼠杂交细胞。细胞融合技术始于20世纪50年代末，60年代后期发明了只让杂种细胞存活并传代的技术。Figure 3-33. The production of hybrid cells. Human cells and mouse cells are fused to produce heterocaryons, which eventually form hybrid cells. These part

49、icular hybrid cells are useful for mapping human genes on specific human chromosomes because most of the human chromosomes are quickly lost in a random manner, leaving clones that retain only one or a few. The hybrid cells produced by fusing other types of cells often retain most of their chromosome

50、s. 2 单克隆抗体技术：抗体：机体对抗原刺激应答所产生的免疫球蛋白，对相应的抗原有特异反应。是B淋巴细胞分化来的浆细胞合成并分泌的。传统抗体的制备： 对动物（兔或山羊）反复注射抗原-数周后抽血-处理全血-除去细胞和凝血因子-获得抗血清-测试抗血清的抗体效价-纯化抗体 类型： 多克隆抗体：众多B淋巴细胞对一种抗原的不同抗原决定簇应答而合成的多种免疫球蛋白，为不均质抗体。 单克隆抗体：从单克隆杂交瘤细胞产生的抗体，为同一类或同一亚类的免疫球蛋白，其独特型和恒定区完全相同，具有高度的特异性。单克隆抗体技术是1975年Milstein和Kohler建立的，并于1984年获诺贝尔医学和生理学奖。原理： B淋巴细胞的免疫（对8-12周龄小鼠进行抗原注射）-分离免疫后小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养液筛选杂交瘤细胞具有稳定生长和抗体分泌功能的杂交瘤细胞的克隆化收获单克隆抗体融合后的杂交瘤细胞具有亲本的特性，既可以分泌抗体，又可以在体外培养或移植到体内无限增殖。 Figure 3-65. Preparation of hybridomas that secrete mo