细胞凋亡的研究方法的建立与评价课件

1、Apoptosis 细胞凋亡研究方法建立与评价蒋纪恺研究生？研究方向研究立题（研究背景、发现问题、提出问题（？）、提出假设、解决问题的策略与方法） 申请课题，获得经费实验验证（实验模型、技术指标、方法建立与评价）结果分析（撰写论文，申报专利，评奖）研究方向：白血病研究立题：肿瘤靶向治疗的分子机制研究。文献 阅读与学习。信号转导在白血病发生 与治疗的背景知识 研究模型：白血病细胞株；动物模型等技术平台：实验技术的建立与评价，（技术指 标，动手能力） 结果分析：统计学知识，文献回顾论文撰写：语言能力研究背景肿瘤治疗手术放疗化疗骨髓移植（白血病） 增殖 分化 凋亡 Survival Growth D

2、ifferetiation Apoptosis 肿瘤 Tumour立题依据增殖：细胞通过分裂使细胞数目增加的过程 ，细胞分裂。（真核细胞的增殖方式有：有丝分裂、减数分裂、无丝分裂三种方式，只有连续进行有丝分裂的细胞才具有细胞周期。 ）分化：在个体发育中，通过细胞分裂后产生的子代细胞比上一代细胞具有更专一的功能。后代在形态结构和功能上发生稳定性的差异过程称为细胞分化（cellular differentiation）。（比如血液中的红细胞、白细胞、淋巴细胞、血小板等都是从造血干细胞分化出来的，但是与造血干细胞相比，这些子代细胞都具有更加专一的功能。 ）凋亡：细胞凋亡指的细胞的程序性死亡，细胞被自

3、身的酶降解，按一定的步骤“自杀”，其死亡细胞仍为一整体，最终被白细胞吞噬。（而细胞坏死会有细胞壁破裂的现象，内含物外泄，会影响周围的细胞。）启动 凋亡早期 凋亡中期 凋亡晚期 Caspase 激活核染色质凝缩 细胞膜PS 外翻线粒体膜电位丧失DNA 被切割成片段凋亡小体形成信号通路研究模型慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML ） 逆转K562 cell line 分化（红系细胞） 增殖 凋亡 药物诱导Leukemia cell linesK562 cellsa bcr:abl positive erythroleukamia line derive

4、d from a 53 year old female CML patient in blast crisisPhiladelphia chromosomeLeukemia cell linesHL60(Human promyelocytic leukemia cells)derived from a 36-year-old woman with acute promyelocytic leukemia at the National Cancer Institute研究方法建立与评价灵敏度特异性蛋白质分析1，染色2，酶3，免疫分泌蛋白、膜蛋白、细胞质，细胞核蛋白方法学建立与研究策略药物浓度的

5、选择（MTT）形态学观察（凋亡小体形成）DNA 被切割成片段细胞膜PS 外翻Caspase 激活信号通路MTT测定细胞增殖MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）是Mosmann1983年报告的。原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为紫红（兰）色的甲（肷）紫,后者溶于有机溶剂（如二甲基亚枫、酸化异丙醇等）,甲紫（肷）产量与细胞活性成正比。可在560nm处用酶标仪测定其OD值。 形态学观察DNA 被切割成片段Annexin V基本原理细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露

6、在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以