USP35-1116中文

1、1116无菌工艺环境的微生物控制和监测在药品行业，微生物控制环境有多种用途。本章节提供了关于通过无菌工艺控制微生物污染的环境的信息和建议。在这些环境中生产的产品包括无菌制剂、无菌原料药、无菌中间体、辅料和部分药用器械。从患者风险的角度来说，无菌工艺环境比其他生产操作的控制环境要重要的多，例如设备和备件的准备、非无菌产品的生物负荷限度控制和最终灭菌产品工艺。本章节中的无菌工艺环境有人和无人操作应区别对待。一个高级无菌工艺是不需要和禁止穿常规洁净服的操作人员直接接触敞口容器或暴露的产品接触表面的。（注意：本章所用的术语在章节最后的目录里有解释。）本章节给出了指导意见和洁净室、限制进入隔离系统（RA

2、BS）和隔离器等无菌工艺的微生物评价的监控参数，其他不要求在无菌条件下生产的无菌产品的生产环境的污染控制要求可以根据ISO环境分类执行。非无菌产品的生产环境要有不同的微生物控制等级。大部分标有无菌的产品是在无菌工艺条件下生产的而不是最终灭菌。因为无菌工艺不仅生产过程中将微生物从生产用蒸汽中排除，并在空的容器进入时也阻止微生物的进入，还将生产环境的生物负荷作为一个控制微生物污染的重要参数。无菌和灭菌并不是一个同义词。灭菌指的是将全部的微生物或组织进行杀灭，有复活的可能性。从纯粹的微生物意义上说，一个无菌工艺可以通过排除微生物的方式防止污染。在现代无菌药品制造业，无菌指的是在一个设计好的受控环境中

3、处理已灭菌的物料使微生物污染处于风险最小的已知水平。在有人进行操作的任何环境中，微生物污染在一定程度上是不可避免的。如果有人员存在的话，即使最谨慎的洁净室环境设计和操作也不能避免微生物的掉落。因此在所有无菌生产工艺操作过程的所有场所达到零污染在技术上是不可能的并且也是不现实的。去证明一个无菌生产工艺的环境和在这个环境中产品接触的表面是已消毒的是没有意义的。应当根据风险评估确定监测点。虽然生产者会经常对环境监测结果进行回顾以确保生产操作在受控的验证状态，但是监测结果不能证明无菌或非无菌。因为监测的局限性，所以生产者不能直接依据监测、统计或定期的无菌工艺模拟来确定灭菌的安全水平。环境监测通常由人来

4、进行，需要操作者的参与，所以环境监测也能增加污染的风险和得到假阳性的结果。因此密集的监测是不必要的，尤其是在无菌生产工艺最关键的的IS05级（B级）的环境中。在无菌生产工艺的微生物状态和环境控制和评价中需要用到一系列的取样方法。现在几乎所有的方法都依赖微生物的生长和回收，这些方法中的大多数都是在环境应力导致的受损的状态下进行的，因此是很难恢复的。本章节中的空气、表面和人员的监测数值不用来作为限度或指标的要求，只是严格的报告数据。鉴于微生物取样工具和方法的多样性，没有充分的理由证明获得这些数值就能证明微生物的到了控制，或短暂的超出这些数值，微生物就失去了控制。在一个有意义的周期内，必须进行和生产

5、环境有关的风险评估。在任何情况下，均应在回顾实际生产调查的基础上确定污染回收率指数。为了促进改善，应当用污染回收率追踪每个使用者连续进行的性能和确定微生物控制程序。当达到一个设备最有利的操作条件时，污染回收率水平典型地变为相对稳定地在一个正常区间内变化。没有标准的空气采样方法，也没有可查阅到的文献方法，表明空气采样方法具有高度的可变性。不能假设相似的采样体积在不同的方法下能得到相似的回收率。许多参数都能影响微生物回收率和存活率，不同的空气采样器生产商的设计可能也使他们的系统满足不同的要求。微生物采样时样品间的差异也是很大的。药品无菌生产工艺监测方法的准确度、灵敏度精密度和检测限的限值是可以得到

6、的。表面采样方法同样也没有标准化。使用不同的介质，在干法、湿法和接触碟法时能得到不同的数据。重复采样的接触碟被认为在相同条件下能得到相似的结果，但是有报道称回收率比期望值低并且具有高度的可变性。总之，即使在标准取样片上具有相对高的接种水平，表面监测方法的回收率也不到50%。在实际的生产环境中，微生物因为应力而具有变化的情况下，回收率可能会更低。高级无菌技术高级无菌技术可以被定义为在生产过程中不依赖人为操作直接干预的无菌技术。现在，隔离器技术、吹灌封一体技术和封闭的限制进入隔离系统（RABS）（在设置和操作时新打开）可以被认为高级无菌技术，这些技术在生产过程中，不允许更衣人员进行直接干预。近年来

7、隔离器技术在制药业的得到了广泛的认可。隔离器和封闭的限制进入隔离系统（RABS）有效地将操作者和关键无菌生产环境隔离开来。因为这些系统大大地降低了污染的风险，所以它们的微生物控制水平比传统的同等洁净度级别的洁净室微生物控制水平高，如IS05级（B级）。无菌生产工艺环境的洁净室级别IS014644系列阐述了洁净室和环境控制区的设计和建造。这个标准用单位体积的总粒子浓度表示洁净环境的性能。IS014644-1规定了不同空气质量级别的洁净环境允许的总粒子数。读者可以据此来考虑设计参数和建立洁净环境。在注射药品生产过程中药品生产人员介入了非活体粒子污染（见微粒物质788）。在微生物污染中，实验数据证明

8、人是唯一重要的来源，而非活体粒子则不同，既可以由人引入，也可以由生产设备中引入。研究表明，更衣人员脱落的微粒和微生物污染的比例是相当稳定的。但是生产设备脱落的活体和非活体污染之间不存在这样的关系。当设备时微粒的主要来源时，微粒主要是非活体。“洁净室中的总粒子数越少，空气中存在微生物的可能性越小”这种说法，只有当人是微粒的来源时才能成立。机械操作造成的背景总微粒污染和人员引入的微粒污染之间并不能进行清楚地区分。因此，洁净室环境监测由总微粒数部分和微生物数部分组成这种做法是比较常见的，也是比较合适的。表1给出了制药企业常见的洁净室等级。在无菌生产工艺中，一般会用到IS014644-1中的5-8级。

9、表1不同洁净级别的总微粒数ISO等级0.5口m的微粒数/m3ISO53520ISO635200ISO7352000ISO83520000注：此表来源于ISO国际标准14644第一部分，由国际标准委员会于1999年5月印刷。ISO14644-1的这四个等级与美国联邦标准209E的等级是一致的，分别是IS05/100级，ISO6/1000级，ISO/10000级，ISO8/100000级。隔离器和封闭的限制进入隔离系统（RABS）则体现了不同的情况，因为人员通过厚的柔软的塑料（如聚氯乙烯或半合成橡胶）制成的手套和袖管组合和半套衣服进行操作，从而被排除在无菌生产工艺环境之外。人对隔离器中物品的影响远

10、小于对洁净室环境中物品的影响。一些用户选择了一种允许开放和直接人为干预的方式对RABS进行操作。在一个开放的操作状态下，这些系统和普通的洁净室环境相似，因此不能被认为是高级无菌工艺系统。在一个开放的RABS中，操作人员的能力对微生物污染的风险的反作用比封闭的RABS或隔离器高。ISO14644和联邦标准209E中都没有包括对每小时换气次数和风速的规定。通常IS08/100000级设计的换气次数不低于20次/小时，ISO10000级设计的换气次数应超过50次/小时，IS05/100级设计的换气次数应超过100次/小时。有些设施的设计标准也有所不同。在无菌生产中，为了稀释和消除污染物，可能需要用大

11、体积的气体来降低洁净室的生物负荷污染。因为一部分污染是由人引入的，最适宜的条件也应该随着过程参数的不断变化而变化。在洁净室的设计和操作中，这些标准只能作为一个指导原则，因为还没有令人满意的实验能表明每小时换气次数、体积和微生物控制之间的精确联系。生产者应使洁净度为5级的洁净室保持一个明显的单向流（垂直或水平方向），尤其是在产品、产品容器和封口物品暴露时。在洁净室中评价气流运动时，采用发烟装置或者其他合适的方法肉眼观察气体的流向比单纯地测量换气体积和换气次数的方法可能要有用的多。风险评估模式也被认为是一个可以降低污染风险的实用方法。在隔离器和封闭的RABS中换气体积和换气次数远不如在洁净室中重要

12、，因为人被很小心地与产品、产品容器和封口用物品分离开了。研究证明在隔离器中足够的换气体积和在RABS中合适的换气体积一般低于有人存在的洁净室中的换气体积。隔离器中微粒对产品质量有影响的区域，可以保持一个明显的垂直或水平方向的单向流。实验表明，控制良好的混合流或湍流在许多无菌工艺和隔离器的灭菌测试中也能达到满意的效果（见灭菌测试-隔离器系统验证）。环境控制的微生物评价的重要性即使使用电子仪器对环境控制中的总微粒子数的进行连续的监测，也未能获得环境中微生物浓度的报告。微粒计数器的根本限制是只能测量粒径0.5pm或更大的粒子。然而，空气中的微生物并不是自由漂浮或是单细胞的，它们通常附着在10到20p

13、m的微粒上。控制环境内的微粒计数也就是微生物计数随着取样点和取样的不同方式而改变。非活性的微粒和微生物的环境监控是一项重要的控制功能，因为要符合注射剂中的可见异物、不溶性微粒与无菌（注射剂）的要求，两者的监控都是很重要的。相对于传统的洁净室而言，在隔离器和封闭的RABS中总微粒数的监测提供了一种更好的环境质量评价方式。在隔离器中，非活性微粒比例增长证明人的污染被很好地得到了隔离。隔离器中总微粒计数可能会提供一个污染水平变化的直接指示。微生物监测程序应该对清洁和消毒效果进行评价，并且对监测人员对控制环境的生物负载的影响进行评价。由于隔离器使用自动蒸汽或气体发生系统进行消毒，在进行消除生物负荷的效

14、能评价时，微生物监测并不十分重要。这些自动消毒系统用合适的生物指示剂挑战进行直接验证，并控制常规使用时的暴露参数以确保可以达到持续的消毒状态。在这些控制环境中的微生物监测不能也无需进行鉴别和量化所有的微生物污染。从技术上来讲，洁净室中的微生物学监测是一个半量化的试验，因为由于取样器具的局限性，对环境进行真正的量化评价是不可能的。计数方法的缺乏和被有效监测的采样体积的限制意味着从环境监测中得到无菌保证的定量信息是不充分的。分析员应谨记：即使没有活的微生物存在，也没有一种取样计划能证明不存在污染。在一个微生物样品中没有生长只说明生长没有被观察到，不代表环境没有污染。常规的微生物监测应能提供足够的信

15、息证明无菌工艺环境在一个适当的控制状态下运行。微生物监测计划中的此项真实数据证明一直在持续、高质量的环境条件下运行。监测计划可以对污染回收率的变化进行检测，从而指示环境控制状态的变化。由具有资格的人员进行的环境微生物监测和数据分析时，可帮助确保环境处于控制的合适状态。为了得到有意义的、与过程相关的数据，可以在正常操作过程中应对环境进行取样当原料存放，或在生产活动持续进行进行，以及操作人员全部在岗时时，应对无菌生产工艺环境进行微生物取样。洁净室、隔离器和RABS的微生物监测应当包括压缩气体、表面、房间、灌装气体和其他物料以及设施等可能产生污染风险的因素。长久以来，在无菌环境中进行污染趋势分析的人

16、员都是环境控制计划的一部分。在无菌生产工艺环境尤其是ISO5级环境中，污染很少被观察到。在人员污染被很好地排除的隔离器中，更是如此。由于这些环境的关键性，即使是污染时间的微小变化也可能是有意义的，生产者应经常和谨慎地回顾监测数据。在非关键区域，微生物污染可能较高，但是仍应注意、调查和纠正回收率的变化。在传统的洁净室中，微生物的隔离回收应该被认为是正常现象，通常这表示不需要进行特别的纠正，因为几乎可以肯定调查者不能找到一个被证实的原因。在传统的洁净室内，由于样品本身要求无菌，任何一个单独的没有关联的的污染事件都可能是假阳性的。当污染回收率超过制定的水平时，必须进行工艺和操作调查。调查将根据制造的

17、产品和使用隔离器、RABS和洁净室等类型而有所不同。调查应当包括区域保持记录的回顾，消毒记录、偏差的发生、内在生理或操作参数，例如环境温度的变化和人员的培训情况。在封闭的RABS和隔离器系统中，手套完整性的缺失和偶然引入未经消毒的物质是可检测到的污染产生的最可能的原因。通过调查，必须采取措施纠正或消除可能导致污染的原因。因为在现代的无菌设施中污染相对稀有，调查结果经常是无果的。当纠正措施实施时，可能包括加强在穿衣、无菌技术、环境微生物控制方面的人员培训。也可能会采取一些额外的微生物取样，但是这在无菌生产工艺中可能并不是合适的，因为增加的或者是过度密集的采样必定使污染的风险变大。只有当无菌工艺模

18、拟研究时，额外取样才时更合适和可取的。其他检测方法被认为可以更好地控制微生物污染，包括额外的消毒、使用不同的消毒剂和微生物污染和来源鉴别。在任何一个传统或高级的无菌环境中，调查和由于调查结果而采取的措施的原因的推理必须谨慎并记录。污染控制效果的实际评估洁净环境应当按照ISO14644系列中的规定进行验收，以达到设计等级的要求。设计、结构和操作都能使洁净室发生很大改变，所以很难对参数如过滤器完整性、换气体积、气体类型、换气和压差等进行概括归纳，特别是关键的应用如无菌工艺结构，接近实际的风险评估是比较合适的。LjungquistandReinmuller曾经开发了一个这样的方法，被称为L-R方法。

19、通过评价气体和环境稀释和移除空气携带粒子的能力来挑战通风系统。在L-R方法中，有一个发烟装置使分析员能够目视洁净室或控制环境中所有区域的空气运动，包括涡流和湍流区域，可以对空气流的类型可以进行调整以使不期望的影响降到最小。通过气流的优化，可以在关键区域和灭菌场所产生微粒。这种评估只能在模拟生产但设备和人员到位的条件下下进行。这种测试同样也能用在RABS和隔离器的能力评价上，尤其是在这些系统中的产品出口附近，以防止污染。洁净室中的空气运动的目视评价是一个主观的过程。在有人员和设备存在的正在运行的洁净室中完全消除湍流是不可能的。空气的可视化只是优化洁净室性能的努力中的一步，并不是确切的通过/失败测

20、试，因为可接受和不可接受的条件还不明确。在执行微生物监测程序之前，对洁净室、RABS和隔离器的实际参数进行合适的测试和优化是必要的。确保洁净室、RABS和隔离器与预定的工程标准相符为控制生物负荷的设备能力和操作实验提供了可靠保障。非活性微粒被用于预定用途。在洁净室和高级无菌工艺系统的验收时应当重复这些测试，并且无论操作如何改变，如人员流动、设备、操作、物料流动、空气调节系统或设备的布局安排，都被看成是很有意义的。人员培训良好的人员操作在污染控制过程中发挥着不可或缺的作用，合适的培训和监督是污染控制的核心，无菌生产的关键活动取决于微生物受控的环境，生产者要努力注意并细化与之有关的所有环节。严明的

21、纪律和对人员严格的监督是保证环境质量适用于无菌工艺的必要要求。对在控制环境中工作的所有人员的培训是很关键的，微生物监测计划中人员责任心也是同样至关重要，因为而在微生物取样过程中，洁净工作区域也可能产生意外的污染。在高度自动化的操作过程中，监测人员应是应该是最直接接触操作区域内的关键区域和表面的人员。微生物取样时，不恰当的取样技术或人员进入或接近关键区域都可能带来微生物污染。必须制定一个培训计划以使污染风险降到最低。所有进入控制环境人员的培训都应当有书面记录。虽然干预不可避免，但监测活动要求将干预降至最低，所以检测人员必须尽可能接近完美地掌握无菌技术。设备管理应必须保证所有在洁净室和高级无菌工艺

22、环境操作的人员都要非常熟悉微生物实验相关的准则。培训应包括，对无菌技术基本原理的说明，还有生产的相关程序和产生污染的潜在原因的处理程序之间的关系。进行监督、审计和检查微生物控制与检测活动的人员必须熟知微生物学的基本原理、微生物的生理特征、卫生与消毒、培养基选择与制备、分类系统级灭菌知识。还应对监督和测试人员进行微生物或环境微生物的理论知识的培训。取样人员等在洁净室单独工作的人员还应牢记将降低微生物污染风险的责任。进行微生物鉴定的人员要按规定的实验室方法进行特殊的培训。必须对操作人员提供额外的管理环境数据的收集训练。认识和了解适用的标准操作规程是至关重要的，尤其是当标准操作规程中规定了在环境条件

23、达到某些情况，必须执行纠正措施的情况下。理解解污染控制的原理同理解药品生产质量管理规范（GMPs）样都是培训计划中不可分割的一部分的，其中也应包括对数据进行调查和分析。人是控制环境中微生物污染的唯一重要来源。由于人会带来污染和无菌工艺的最终目的降低最终用户的风险，只有健康的人员才能进入控制环境。即使是在高级无菌技术如隔离器、灌/封/装系统或封闭的RABS中，生病的人也不允许进入无菌工艺环境。不能忽略良好的个人卫生和对无菌更衣过程细节的关注的重要性。根据控制环境级别和系统本身标准的不同，更衣程序也有所不同。无菌工艺环境要求无菌衣必须具有最好的滤过性能。要求尽可能全地覆盖住皮肤，袖口或带子在关键的

24、手套-袖子连接处应尽可能少地露出。在传统的洁净室中，在任何条件下都不能看见暴露的皮肤。，人员和更衣在RABS中与在传统洁净室中是同等重要的。当员工正确地进行更衣后，还必须时刻小心地维护手套、口罩和衣服的完整性。隔离器的操作人员不必穿无菌衣，但在隔离器、RABS和洁净室中的无菌操作中，无菌技术的缺乏和人员脱落的污染仍然是最基本的危害。手套和袖管组合发生的泄露可以将微生物从机器转移到产品中。在隔离器或RABS的手套外面或里面套上第二层手套可以增加手套泄露的安全水平或者作为完整性测试的措施。同时，操作人员必须谨记：在隔离器和RABS系统中，无菌技术要求所有操作必须在戴手套的情况下进行。环境监测计划本

25、身并不能检测到无菌生产过程中的破坏环境微生物质量的所有事件，因此必须进行周期性的培养基灌装实验或无菌工艺模拟研究，以进行全面的持续不断地监督，确保操作控制和培训效果的维持。微生物环境监测计划的设计和执行中的关键因素综合的环境监测计划出现以后，它们在不利趋势或漂移的确定方便的应用就得到了重视。在现在无菌工艺环境中，无论是在隔离器、RABS或传统的洁净室中，污染增加变得十分稀有，尽管如此，监控计划也应当能检测到设施中验证状态的变化，并为实施适当的计数提供信息。环境监测计划应根据特定的设施和条件进行调整，也必须在数据信息方面有助于进行全面的规划。在无菌取样方法存在技术限制的背景下，某一天一个单一的不

26、相关的数据可能并没有实质意义。培养基的选择一般的微生物培养基如大豆酪蛋白消化培养基（SCDM）因为能使细菌、酵母菌和霉菌生长，适合大多数条件下的环境监测。可以在这些培养基中加入添加剂使之克服或减少消毒剂或抗生素的影响。生产者应该关注霉菌和酵母菌的检测，如有必要，可以使用沙氏、改良沙氏或抑制霉菌琼脂等普通的真菌培养基。一般来说，对专性厌氧菌不起作用，因为这些生物在环境气体中不可能存活。但是在无菌工艺中可能观察到微需氧菌。如果存在缺氧条件（如在无菌测试设施中对这些微生物的鉴别或无菌检查71），应能保证微需氧菌和生物体的监测在低氧条件下的生长。每种用于环境监测的培养基，包括用于回收特定类型微生物的培

27、养基必须进行促生长能力的评价（无菌检查71）。培养条件的选择一旦已选择了合适的培养基，则要选定合适的培养时间和温度。一般来说，对于一般微生物生长培养基，如大豆酪蛋白消化培养基，培养温度在2035C范围内，使用的培养时间不少于72小时。当已知污染物生长缓慢时，可以延长培养时间。上述的温度范围并不是绝对的。一般设施环境中常见的嗜温细菌和霉菌可以在较宽的温度范围内生长。对于大多数嗜温微生物来说，在超过约20C的温度范围下回收是可能的。如果没有足够的保证，一个碟子微生物可以在较低或较高的温度下都进行培养。首先在低温下进行培养，确保比较重要的与人类密切相关的革兰氏阳性球菌的生长。培养及制备过程中的灭菌操

28、作必须进行验证。当在监测中使用选择性培养基时，培养条件必须考虑现有技术的要求。在采样过程中应禁止向洁净室中引入污染，所以严禁使用污染的培养基或设备。尤其应注意的是无菌采样培养基的使用。无论什么情况下，采样培养基和包装必须进行严格的湿热、射线或其他合适的方式灭菌。如果必须使用灭菌制备的培养基，分析员必须先进行预培养，并且在进入洁净室之前目视观察所有采样用培养基。如需进一步了解有关微生物实验室操作和控制的信息，请参考微生物实验室操作规范.采样计划和采样点的评估在最初启用或授权洁净室或其他控制环境的同时，应确定空气采样和表面采样的位置。取样点必须考虑接近接近暴露的产品容器、封口物品和与产品接触的表面

29、。在无菌工艺中，产品容器、封口物品和产品暴露的区域常叫做关键区域-通常为ISO5级。为了无菌操作的需要，整个关键区域应是无菌区域。非灭菌物品，包括洁净室操作人员戴手套的手或隔离器/RABS中的手套在无菌操作前或无菌操作中都不能和灭菌产品、容器封口、灌装台或输送设备直接接触。操作者和环境监测人员都不能触摸传送装置、灌装针头、组装加料斗或其他任何一个产品输送过程中的设备。这样才能保证在无菌操作结束时最完美地进行表面监测。采样频率取决于在环境中进行的生产工艺。总体的生物负荷水平较低的非无菌产品生产区，环境监测的频率可相对较低。实施封闭操作，如发酵、无菌API工艺和化学操作的环境的监测点可更少，频率更

30、低，因为周围环境导致微生物污染的风险较低。无菌工艺生产的环境监测比最终灭菌之前的产品灌装环境监测更加关键。最终灭菌之前的产品灌装操作的监测数量取决于受残留产品影响的程度和微生物污染的繁殖能力。对随后的灭菌有影响的微生物鉴别和技术比对周围生产环境的微生物监控要关键的多。不可能对每一种生产环境的微生物控制水平加以建议。例如，一个ISO7级环境已确定的微生物控制水平在另一个IS07级环境下不一定合适，这主要取决于每个环境下的生产活动。用户应进行预期风险分析并为每种控制环境的取样点和取样频率建立依据。洁净室的级别有助于确立控制水平，但并不意味着在同一级别下所有房间应具有相同的控制水平和相同的监测频率。

31、监测应能反映生产或工艺活动中的微生物控制的要求。正式的风险评估技术可以形成一个科学有效的污染控制程序。表2给出了频率渐减的、与重要性或取样取产品风险相关的采样频率。这个表格对人员无菌更衣的无菌工艺环境和不需无菌更衣的环境进行了区别。环境监测计划的检测频率应是灵活的，取样点应根据观测到污染数和持续的风险分析进行调整。在长期观测的基础上，生产者可以增加或减少预定的取样点或者是取消一个采样点。过度采样和采样过疏对污染控制都是不利的，谨慎地考虑风险和减少污染源都可以指导采样密集度。表2：无菌工艺区的建议采样频率采样区域/采样点洁净室关键区域（IS05级或更好区域）气体采样表面监测关键区域的邻近区域所有

32、采样其他非邻近区域的无菌区所有采样隔离关键区域（IS05级或更好区域）气体采样表面监测隔离器周围的非无菌区所有采样在这些环境中的操作人员均应进行无菌更衣（无菌产品的生产区域或其他不需要完全无菌更采样频率/RABS每次运转轮换时操作结束时每次运转轮换时每天次普器每天次活动结束时每月一次隔离器周围环境除外）。这些推荐值不适用于衣的控制环境。洁净室和无菌工艺区采样点的选择ISO14644给出了一个的洁净区微粒空气分级的表格。这个方法适用于确定总体的空气微粒指标是否达到了设计要求。虽然，一般来讲，这个没有人活动的表格值可能具有一定的污染风险，但在进行微生物污染风险分析时也有一定的价值。微生物污染与操作

33、人员密切相关，所以无人环境的微生物监测的价值有限。微生物采样点的选择需要考虑生产操作过程中人员的活动。在洁净室评定阶段的观测和绘图可以提供活动和人员位置的有效信息。这些观测也可以得到频繁的熟练操作和干预的重要信息。洁净室内人员的位置和活动与对环境和环境中的生产操作的污染风险有相关性。应选择合适的取样点，因此应评价区域内的人员活动和工作的影响，尤其是在关键区域内的干预和操作。最可能的污染路线是空气携带，因此，在风险评估中，与暴露的灭菌物料附近的空气携带污染有关的样品是最关键的。其他需要考虑别的区域是设备和物料从较低级别向较高级别传递点。门和气锁的周围及内部也应包含在监测日程内。习惯上对墙壁、地面

34、进行取样，在这些位置的真实的取样可以提供消毒计划的有效性的信息。在这些位置的取样可以相对地不经常进行，因为这里的污染不可能影响产品。操作人员应禁止触摸地面和墙壁，从这些表面至产品暴露的关键区域内的机械传输污染不应发生。生产者通常进行的关键区域内的表面监测应在操作结束时进行。应当避免培养基和湿拭子上的稀释液在表面上的残留，因为它们能导致微生物的繁殖。清洁表面上的稀释液或培养基需要人为的干预和活动，这可能会将微生物污染带至关键区域，也可能扰乱气流。洁净室、隔离器和RABS的微生物控制参数自从20世纪80年代早期，生产者们便确立了警戒限和行动限的环境监测水平。近年来，警戒限和行动限的数值差异已经变得

35、很小，尤其是在IS05级环境下。微生物试验中的生长和回收在土O.5log10之间小幅变动。实际上。对微生物气体取样器的研究显示通常的气体采样设备能产生10倍的差异。因为这些内在差异和不可控的取样错误，设定的的警戒限例如为1cfu和行动限为3cfu并不具有分析意义。数值的变化并不是符合科学逻辑的，也不一定是人为活动影响的结果，可以将正常变化范围的变化看成是预期以内的变化。实际上，变化值达到5-10倍时，可以看做是有意义的变化。因为微生物生长的准确度和精密度与回收试验的局限性，分析员可以考虑污染检测到的频率，而不是某个样品中检测到的cfu数。这也不是简单地微生物直接计数，而是对可能由一簇微生物引入

36、的污染的检测。应对确定每个洁净室环境的污染回收率，一个点和房间的污染回收率发生变化表明需要采取纠正措施。ISO5级的关键区域的空气携带或表面污染的回收率在现有方法水平下应达到1%或更低。在已有的监测方法的基础上，封闭的RABS和隔离器的污染回收率应明显更低,并检测到小于1%。同一采样周期内一个环境内多个点观测到污染表明产品的污染风险增加，并应谨慎地评估。多个点几乎同时出现污染也可能是来源于低劣的取样技术，因此在做出关于失控趋势的分析前应谨慎地进行回顾。在污染后对一个环境重新取样几天不具有什么价值，因为一次取样和另一次取样进行时的条件并不完全一致。无菌衣也能产生表面样品。必须重视操作时的人员取样

37、，为了避免其他污染，最好是在生产结束时进行。这些取样点的平均值应小于1%。封闭的rabs和隔离器的手套应达到比污染回收率0.1%更严格的要求。由于微生物取样方法的内在差异，污染回收率是一个在趋势结果方面比关注某个取样点的数值变化方面更有用的参数。表3列出了无菌工艺环境推荐的污染回收率。事件率是指环境样品发现微生物污染的比率。如，事件率为1%意味着1%的样品发现了污染，而不管这个污染是不是菌落。也就是，99%的样品是完全没有污染的。在进行低风险活动的相似房间，污染回收率比表3中的推荐值高也是可以接受的。当污染回收率趋势在持续一段时间内高于推荐值，应该采取一定的行动。表3推荐的无菌环境初始污染回收

38、率房间级别动态空气样品（%）沉降碟（9cm）/暴露4小时（）接触碟（）手套或衣服（）隔离器/封闭的RABS（IS05或更好）0.10.10.1IS051111IS063333IS075555IS0810101010在这些环境中的操作人员均应进行无菌更衣（隔离器周围环境除外）。这些推荐值不适用于无菌产品的生产区域或其他不需要完全无菌更衣的控制环境。检出频率的制定应根据实际的监控数据制定，并每月进行评估。行动限应根据实验操作能力制定。如果检出频率超过了表3的推荐值或者超出了确定的生产能力，应实施纠正措施纠正措施包括但不限于下列内容：回顾消毒计划，包括抑菌剂的选择、使用方法和频率。增加人员操作的监视

39、，可能包括无菌方法和技术的书面评价。回顾微生物取样方法和技术。当手套和无菌衣的污染回收水平高出正常水平时，纠正措施还应包括对更衣操作的额外培训。有效的短暂偏离一个IS05环境的样品在15cfu以上的偏离，无论是空气、表面或人员都应当极少发生。在这些偏离在ISO5的接近产品和组分的关键区域内发生时，都表明严重的失控。因此所有ISO5中15cfu的偏离都应进行细心而全面的调查。应重点关注回收菌落的非常高的数值，无论它是单独存在或与其他回收菌落相关联存在。微生物检测人员应回顾非常高的数值发生前至少两周的回收率，才能发现其他表现不正常的回收。微生物检测人员应谨慎地考虑所有的回收率，包括通常在1-5cf

40、u之间的回收。在执行调查时，微生物鉴别是一项重要因素。由于独立的一个偏离几乎不可能指向一个确定的原因，只能考虑总体相关测试。当没有明确的科学数据时，要给出一个根本原因是不明智的。同时，也要了解微生物分析的多变性实际上，没有一个科学的原因能将25cfu和15cfu进行区别。在无菌生产工艺中，不应将15cfu作为一个有意义的数值，因为实际上它和14cfu没什么区别。微生物检测人员应用他们的方式对偏离进行实际的科学的判断。数据解释的进一步思考在高质量的无菌工艺环境中，检出频率通常应当很低。可以有表3的推荐回收率看出，无菌工艺中的多数样品可能得到的污染回收率为0。在无菌工艺操作的最关键区域，希望得到回

41、收污染物的样品比1%更少。在大多数使用分离技术的高级现代无菌工艺中，如隔离器和封闭的RABS，所有的回收率可能都是0.对环境控制和灭菌保证负责的微生物检测人员不应当将此认为环境质量已达到灭菌状态。微生物取样系统在所有项目的灵敏度是未知的。在环境监测中，0的结果只意味着结果在检测系统的检测线以下。不应当从无菌工艺的污染回收的频率低得到错误的安全意识。灭菌保证是通过关注人类携带的污染和最大限度地减少这些污染的设备设计特征来最好的实现的。通过合适的设备设计和为设施中的人提供充足的换气次数来减少或消除人类的干预可以最大限度地减少风险。其他的风险降低因素包括有效的人员和物料活动、对温湿度的合理控制；其次

42、还有清洁和消毒。预先分析工艺，通过减少操作干预降低人类污染风险的风险分析模式是一个在灭菌保证方便比监测方面更有力的工具。环境监测不能证明一批产品的所有方面都是无菌的，也也不能证明是非无菌的。环境监测只能保证在这个工艺中生产系统处于一个持续、有效的控制状态。应注意避免通过监测结果得到错误的结论。空气微生物采样最常用的监测无菌环境的工具是撞击取样器和离心取样器。下面列出了一系列常见取样器，以供参考。选择、实用性和正确地使用一种特定的取样器是使用者的职责。狭缝-琼脂空气采样器（STA）-这个装置由一个相连的真空源提供动力。采集的空气通过一个标准狭缝，达到底部缓慢旋转的营养琼脂培养皿上。空气携带的微粒

43、具有足够的质量撞击琼脂表面，并且可培养的微生物在上面生长。一个长的空气吸气管用来降低对不定向气流的扰乱。筛网撞击式取样器-装置由一个盛有营养琼脂培养皿的容器组成。单元盖子是凿孔的，带有预定尺寸的穿孔。真空泵通过盖子采集一定体积的空气，空气中包含微生物的粒子撞击皮氏培养皿中的营养琼脂培养基。一些采样器具有一系列筛网，不同级的筛网上的孔径尺寸渐减。这些单元可以根据微粒通过不同孔径的小孔落到琼脂平面来测定包含可观测微生物的空气粒子的粒径分布。离心采样器-这种装置包括一个螺旋推进器或涡轮机，将一定体积的空气推进，然后推进空气切向撞击放置在活动塑料平板上的营养琼脂条。灭菌微生物腔-这是一种单级筛网撞击采

44、样器的改良装置。单元盖上有特殊分布的约0.25英寸大小的孔。装置底部有一个含有营养琼脂的培养皿。真空泵控制空气运动通过采样单元。也有使用集成采样单元和远程采样探针的。表面空气系统采样器-整个单元包括盛有琼脂接触平皿的进样部分，紧挨着平皿下是一个发动机和涡轮机推动气体通过打孔的盖子到达琼脂接触平皿，并通过发动机排出。也有集成形式的装置。明胶滤镜采样器-在滤镜底座上一个具有延伸软管终端的真空泵可以到达关键区域的角落。滤镜包括能够截留空气微生物的随机光纤。经过一定的暴露时间后，过滤器被在无菌条件下转移并在合适的溶剂中溶解，然后置于合适的琼脂培养基上评估微生物效力。沉降碟-这个方法被广泛用作取样，和作为通过延长暴露时间定性评价环境的一种廉价方式。有报道数据表明沉降碟在暴露4-5小时后可以提供一个适合评价无菌环境的检测限度。沉降碟可能对关键区域尤为有效，因为动态取样和无菌操作可能干扰并对环境造成危害。机械空气取样的一个主要缺点是用于测试的有限的取样体积。当控制环境的空气微生物水平希望达到每单位体积的污染水平极低时，至少应测试1立方米空气以达到最大灵敏度。通常，狭缝-凝胶采样器具有80L/min的采样能力（表面空气系统的采样能力稍高）。如