泽泻翻译定稿

1、响应面分析法优化泽泻中泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯提取工艺A Yeong Lee1 Jun Yeon Park,1 Jin Mi Chun,1 Byeong Cheol Moon,1Byoung Kab Kang,2 Young Bae Seo3 Hyeun-Kyoo Shin,4 andHo Kyoung Kim1lHerbal Resources Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, Republic of Korea 2Brain Disease Research Center, Korea Ins

2、titute of Oriental Medicine, Daejeon,Republic of Korea 3Department of Herbalogy, College of Oriental Medicine, Daejeon University, Daejeon, Republic of Korea 4Herbal Medicine EBM Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon,Republic of Korea泽泻为泽泻科多年生草本东方泽泻Alisma orientalis(Sam) Juz

3、ep.及其同种的干燥块茎。 用于治疗脂溢性皮炎、湿疹、烦渴和足部水肿。我们使用配有二极管阵列检测器的高效液 相色谱测定了存在于样本草药中泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的浓度，鉴于泽泻萜醇B和 泽泻萜醇B乙酸酯的结构，我们选择了甲醇作为最佳溶剂。我们估计泽泻萜醇B和泽泻萜醇 B乙酸酯在标准提取物和甲醇中的含量分别为0.0434%和0.2365%。为了优化提取工艺，我们 采用响应面分析法来预测泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的产率。该法是由15个实验组成的 一个中心复合设计。我们以提取时间、溶剂浓度和样品重量作为提取参数。在提取时间81 分钟、甲醇浓度76%、样品重量1.25克时，泽泻萜醇B衍生物的预测

4、浓度值为0.2388%。关键词：泽泻；泻萜醇B；泽泻萜醇B乙酸酯；HPLC-PDA ；优化；响应面分析刖言传统草药是人类历史上文献记载最全面的民间药物之一。自古以来，许多东方国家已 经使用传统草药治疗大量疾病以及保持身体健康。1- 3但管许多传统草药具有临床疗效， 它们所包含的一系列复杂的化合物却很少能被标准化认知。液相色谱是一种分析复杂混合 物的强大工具。常用于分析那些从传统草药中发现的化合物。囹近年来，传统中药通过使用 以液相色谱为基础的多种创新技术已经实现标准化认知。这些新技术包括包括毛细管电泳 法、液质联用、胶束电动毛细管色谱法、高速逆流色谱法等等。36泽泻为泽泻科多年生草本东方泽泻A

5、lisma orientalis(Sam.) Juzep.及其同种的干燥块 茎。7-8这种草药被用在一些东方制剂如Taeg-Sa-San和O-Ryeing-San1治疗脂溢性皮炎、 湿疹、烦渴、足部水肿等。9 -11 此外，泽泻是一种有名的东亚药物，在中国、日本、韩国 和北美等地长期用来治疗感染、炎症、过敏、利尿、动脉粥样硬化、高脂血症、肾结石和 糖尿病等。W2 - M泽泻含有三萜类成分，包括泽泻萜醇A、B、C、泽泻醇A 24-乙酸脂、泽泻萜醇B 23- 乙酸脂、泽泻醇、环氧泽泻烯、表泽泻秘以及糖类，如葡萄糖、果糖、蔗糖等等。8-9-12、 14 -16值得一提的是，泽泻萜醇B乙酸酯是具有几种

6、生物活性的重要化合物，包括抑制脂多 糖诱导mRNA对诱导性一氧化氮合酶和一氧化氮产物的表达。它同样被发现能够抑制补体 结合和抗体介导的过敏反应。3早期的几份报告已经使用HPLC-UV和HPLC-ESI-M S技术测出泽泻中24-乙酰泽泻萜醇 A，23-乙酰泽泻萜醇B，23-乙酰泽泻萜醇C和泽泻醇各自的含量。9-13-14-17-18但尚无泽泻 醇衍生物的最佳提取条件的研究。在本研究中，我们通过使用基于泽泻萜醇B和泽泻萜醇B 乙酸酯浓度的曲面模型来探索其最佳提取条件。实验植物材料泽泻标本收集于韩国顺天市，由大田大学的Young Bae Seo教授进行鉴定和干燥。泽 泻(ALR 09)的凭证标本被

7、存放在韩国东方药物研究所(KIOM)草药资源研究中心的标本馆。化学物质泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯标准品(图1)购于和光化学纯品实业公司(日本大阪)。高 效液相色谱级甲醇、乙醇、异丙醇，正己烷、二氯甲烷、乙腈和蒸馏水由J.T.Baker股份有 限公司(Phillipsburg,NJ,USA)制得。最佳溶剂的样品制备使用搅拌机(Shini l实业有限公司，韩国京畿道)将泽泻混合并磨成能通过相应型号筛子 的粉末。为了确定最优溶剂，将等份1.0克样品粉末用25mL甲醇、乙醇、异丙醇、正己烷 和二氯甲烷等溶剂超声提取2小时，并在50毫升容量瓶定容。注射前，用0.2微米膜过滤器 将2.0毫升溶液滤过(P

8、ALL Corporation, Ann Arbor, MI,USA。在三个独立变量下对提取样本 进行分析。选择最优溶剂后，样品通过响应面分析法设计进行实验。E图1泽泻萜醇B和泽泻萜醇B壶酯的化黑构试验设计和响应面分析这个实验的三个测量变量分别为提取时间（X1）,甲醇浓度（X2）和样品重量（X3）。我们 分配五个水平（2、1、0、1、2）给两个因变量:泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的浓度（表1）。 实验的15个因素作为中心合成设计（CCD）的因素，符合n=2k+2k+n0，其中k是因素数量。19-23 接下来，就截距、线性、平方和和交互作用按下述函数执行回归分析，其中P0，队（i=1，2, 3）

9、，p.（i=1，2，3； j=1，2，3，i扇 OO图2关于泽泻萜醇B(前峰)和泽泻萜醇B乙酸酯(后峰)最适分析色谱柱的色谱图:XTerra RP18(A)，Atlantis dC18(C)和 Luna 5g C18 100A。(见联机彩色图形)。在同一条件下，泽泻萜醇B乙酸酯保留时间分别为21，35和32分钟左右。两个标准 化合物在Atlantis dC18柱的条件下出现拖尾峰。在其他两个色谱柱下峰形是好的。我们选 择了 XTerra RP18柱，是因为它可以减少分析时间。25-26我们的泽泻样本所含有的泽泻萜 醇B和泽泻萜醇B乙酸酯在XTerra RP18色谱柱中大约15和21分钟开始出峰

10、(图3)。0.20-E I I I I I I | I I E I J I 1 I T J I I I II I I 3 J I I I | J I il I F0.005.0010.00i5.M 加 25.00 3DC0 ASM图3泽泻（A）,泽泻萜醇B乙酸酯（B）,泽泻萜醇B （C）在XTerra RP18色谱柱条件下的色谱图。 （见联机彩色图形）泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的浓度变化范围分别为0.4-120pg/mL和0.5-100pg/mLo其回归方程（相关系数）通过计算分别为：y=76030.232 x +16057.012（R2=1.000）和 y=59806.416 x+9131

11、.577（R2=1.000）。（表 2）。泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的检测限（LOD）分别为0.082pg/mL和0.114pg/mL。泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的定量限（LOQ）分别为0.249pg/mL和0.344pg/mL。两标 准化合物日内和日间精密度相对标准偏差分别小于1.0%和5.0%（表3）。准确度通过回收率 实验测定，该测试中我们添加了 12pg/mL的标准泽泻萜醇B和50ug/mL的泽泻萜醇B乙 酸酯。泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的回收率平均值经测定分别为103.6%和106.4%。 这证明该方法具有好的线性，精密度和准确度。表2泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的线性和精密度

12、分析物回归方程相关系数（R2）变化范围（口g/mL）泽泻萜醇BY=76030.232X+16057.0121.0000.4-120泽泻萜醇B乙酸酯Y=59806416X+9131.5771.0000.5-100提取溶剂的优化我们使用6个溶剂:甲醇、乙醇、异丙醇、正己烷、二氯甲烷和乙腈来测定泽泻萜醇B 和泽泻萜醇B乙酸酯的含量。为了选择最佳的提取溶剂，我们计算了两种化合物总提取浓 度。在二氯甲烷中，未检测到泽泻萜醇B，只能到检测痕量的泽泻萜醇B乙酸酯。乙醇和 乙腈溶剂中两个化合物都具有很高的浓度。在甲醇中泽泻萜醇B衍生物的浓度最高，大约 为0.2799%（表4）。提取温度、时间、溶剂浓度、样品重

13、量都影响天然产物的产率。特别是低浓度乙醇和水的混合溶剂通常用于提取天然产物。23通过预实验，从各种醇类中选择出 甲醇。甲醇提取物检测到的泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的含量是最高的。拟合模型从泽泻中提取的泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的所有实验数值已列于表5中。这些 数据被用来计算二阶多项式的系数，如表6所示。在这个模型中，各响应变量的重要性随 着回归系数的增加和p值的降低而增大。R2的值总是在0和1之间，并且预测模型越有 预测性越强化，R2越接近1.00。28在本试验模型中，通过使用双组份的总值计算得出相关 系数R2的值为0.9922。F实验计算出较高的F值（F=56.40）和较低的P值（p0.

14、001）， 表明我们的模型显著有效。这些值表明此二阶多项式能够充分代表实验数据。表3泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯浓度的日内和日间精密度的变异性浓度哽/mL检测浓度（gg/mL日内RSDa(%)准确度b（%）日间检测浓度（gg/mLRSD(%准确度（%ABC1212.040.50100.3511.554.6696.236061.400.20102.3360.421.35100.70ABAd5051.570.44103.1350.911.02101.8210099.070.6999.0799.230.4299.23aRSD（%）=100 xSD/平均值b精确度（）=1-（实际浓度-测定浓度平均值）

15、/实际浓度x100cAB= “泽泻萜醇B”的缩写dABA= “泽泻萜醇B乙酸酯”的缩写表4不同溶剂中泽泻中泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯含量溶剂泽泻萜醇B含量（% ）泽泻萜醇B乙酸酯含量(%均值标准差相对标准差均值标准差相对标准差甲醇0.04340.00030.80480.23650.00190.8095乙醇0.03940.00051.30310.23040.00451.9325异丙醇0.03480.00144.13570.22120.00391.7410乙月青0.04000.00092.32580.22990.00331.4517二氯甲烷N. D.a0.01510.001510.0894正已烷

16、0.01820.00063.13470.16640.00221.3147aN.D.=“未检出”的缩写响应面分析法方程式(2)显示了两个化合物的含量与提取因素的关系Y=-0. 206851 - 0. 000309X1+0. 011077X2 -0. 004481X3+ 0. 000001680X2- 0.000005017X1X2 -0. 000063629X22+ 0. 000077500X3X1 +0. 000211X3X2 - 0.004952X23(2)表5三个实验变量和响应变量的实验结果的中心复合设计矩阵序号X1 （分）X2（%）X3 （克）泽泻萜醇B泽泻萜醇B乙总产率（）（%）酸酯（

17、）60 （-1）25 （-1）1.0（-1）0.00060.00170.00231（0.0001）（0.0001）（0.0002）60 （-1）25 （-1）2.0（1）0.00060.00190.00252（0.0001）（0.0001）（0.0003）60 （-1）75（1）1.0（-1）0.03330.19660.23003（0.0017）（0.0059）（0.0075）60 （-1）75（1）2.0（1）0.03510.20170.23684（0.0012）（0.0065）（0.0074）120 （1）25 （-1）1.0（-1）0.00050.00230.00285（0.0001）（

18、0.0001）（0.0001）120 （1）25 （-1）2.0（1）0.000110.00270.00386（0.0001）（0.0005）（0.0001）120 （1）75（1）1.0（-1）0.02930.18220.21157（0.0016）（0.0062）（0.0074）8120 （1）75（1）2.0（1）0.03250.19440.2269（0.0010）（0.0016）（0.0023）9150 （2）50（0）1.5（0）0.02260.13830.1609（0.0014）（0.0098）（0.0106）30（-2）50（0）2.5（0）0.02500.15650.181410

19、（0.0014）（0.0092）（0.0112）90（0）100 （2）1.5（0）0.03120.20940.240511（0.0011）（0.0024）（0.0033）1290（0）0（-2）1.5（0）N.D.aN.D.N.D.1390（0）50（0）2.5（2）0.02100.12970.1506（0.0011）（0.0076）（0.0087）90（0）50（0）0.5（-2）0.02060.14910.169714（0.0010）（0.0048）（0.0055）90（0）50（0）1.5（0）0.02260.14810.170715（0.0012）（0.0080）（0.0091）aN

20、.D.=“未检出“”的缩写表6提取条件下独立变量Y的回归模型变异分析变量DF平方和R2F值P值线性30.1018210.8520145.290.0002*二次项30.0165740.138723.650.0052*矢积30.0001800.00150.260.8537总模型90.1185750.992256.400.0007*P 值 0.01.*P值 0.001每个相关系数的显著性通过Students t实验和P值来检验。相关系数的显著性随吞值的 增大以及P值的减小而增大。23 对于提取浓度来说，线性和二次项都是显著的。甲醇浓度 对于泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯的产率具有显著的负二次效应，尽管

21、这个效应未通过显 著性检验。提取时间未表现出显著的影响。(表7)图4为泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯产率相对于提取时间(X1)，提取浓度(X2)和样品重 量(X3)的响应曲面图。图4A，B显示泽泻萜醇B衍生物的含量在高浓度甲醇中呈现增加的趋 势。图4C显示含量与提取时间和样品重量无较强的关联性。通过使用响应面分析法，我们所预测的泽泻萜醇B衍生物的最大含量为0.2388%，提取 时间81分钟，甲醇浓度76%，样品质量1.52克。而实际最大含量是在提取时间为90分钟， 甲醇浓度为100%，样品质量为1.5克的条件下测得的，为0.2405%。尽管预测的提取浓度和 实验值有轻微的差异，但是预测的提取时间

22、和样品重量值和实验值很接近。表7 CCD实验数据的回归结果参数参数估计标准误差t-值P-值截距-0.2068510.106497-1.940.1240X1-0.0003090.0011350.270.7989X20.0110770.0014047.890.0014X3-0.0044810.068080-0.070.9507X1X10.0000016800.0000051200.330.7593X1X2-0.0000050170.0000072050.700.5246X2X2-0.0000636290.000009578-6.640.0027X3X10.0000775000.0003600.22

23、0.8402X3X20.0002110.0004320.490.6510X3X3-0.0049520.018533-0.270.8015*P 值 0.01OGCO30-0=0025图4泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯产率的响应曲面图参数X1 （提取时间），X2 （提取浓度）和职3（样品重量）关于（联机彩色图谱）结论我们使用响应面分析法优化了泽泻萜醇B衍生品的提取条件。实验模型回归系数为 0.9922，显著性水平低于0.05%。提取浓度和线性及二次项具有显著的关联性，其他的参数 关联不显著。通过响应面分析法，我们所预测到泽泻萜醇最大的含量0.2388%，最佳提取 条件为：提取时间81分钟，甲醇浓度7

24、6%，样品重量1.52克。尽管预测的甲醇浓度和实验 值有轻微的差异，但是预测的提取时间和样品重量和实验值很接近。我们研究发现甲醇的 浓度对从泽泻中所提取的泽泻萜醇B和泽泻萜醇B乙酸酯含量具有直接影响。致谢本研究由东方药物研究所“基础中草药资源实际应用的建设” （K10020）和“优质草 药选材和质量控制的研究”项目支持。该项目是由韩国教育科学技术部和卫生福利部提供 资金支持。参考文献Hu, Y. M.; Wu, G. H.; Sze, S. C.-W.; Ye, W.; Tong, Y. Quality Assessment of Cortex Phellodendriby high-Perf

25、ormance Liquid Chromatography Coupled with Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Biomed. Chromatogr. 2010, 24, 438-453.Monden, T.; Hosoya, T.; Nakajima, Y.; Kishi, M.; Satoh, T.; Hashimoto, K.; Kasai, K.; Yamada, M.;Mori, M. Herbal Medicine, Hachimi-jio-gan and Its Component Cinnamomi Cortex Ac

26、tivate the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha in Renal Cells. Endocr. J. 2008, 55 (3), 529-533.Huang, Y.-T.; Huang, D.-M.; Chueh, S.-C.; Teng, C.-M.; Cuh, J.-H. Alisol B Acetate, a Triterpene fromAlismatis rhizome, Induces Bax Nuclear Translocation and Apoptosis in Human Hormone-Resist

27、ant Prostate Cancer PC-3 Cells. Cancer Lett. 2006, 231, 270-278.Chen, L.; Qi, J.; Chang, Y.-X.; Zhu, D.; Yu, B. Identification and Determination of the Major Constituents in Traditional Chinese Medicinal Formula Danggui-Shaoyao-San by HPLC-DAD-ESIMS=MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009, 50, 127-137.Yu,

28、K.; Gong, Y.; Lin, Z.; Cheng, Y. Quantitative Analysis and Chromatographic Fingerprinting forthe Quality Evaluation of Scutellaria baicalenesis Georgi Using Capillary Electrophoresis. J. Pharm.Biomed. Anal. 2007, 43, 540-548.Zgorka, G. Retention Behavior of Silica-Bonded and Novel Polymeric Reversed

29、-Phase Sorbents in Studies on Flavones as Chemotaxonomic Marker of Scutellaria L. Genus. J. Chromatogr. A. 2006,1120, 230-236.Lee, J. C.; Lee, E.; Lee, Y.-C. Effects of Rhizoma Alismatis on Lipid Composition and TBARS Concentration in Rat Fed High Fat Diet. Kor. J. Herbology 2008, 23 (3), 113-117.Ki

30、m, S. E.; Rhyu, D. Y.; Yokozawa, T.; Park, J. C. Antioxidant Effect of Alisma plantago-aquatica var.orientale and Its Main Component. Kor. J. Pharmacogn. 2007, 38 (4), 372-375.Ahn, M.-J.; Lee, C. H.; Shin, Y.-W.; Chun, M.-S.; Kim, C. Y.; Kim, J. Determination of Alisol B23-Acetate and Alisol C 23-Ac

31、etate in Alismatis Rhizoma by HPLC-ESI-MS. Nat. Prod. Sci. 2008,14 (3), 152-155.Lee, S.-I. Studies on the Diuretic Action of Oryeongsan and Kami-Oryengsan. Kor. J. Pharmacog.1981, 12 (1), 31-43.Jo, Y. D. Nephroprotective Effects of Taeksa-San Aqueous extracts on cisplatin-induced rat acute renal fai

32、lure.Degree of Master, Deagu Haany Unversity, 2009, pp 1-2.Lee, J.-H.; Lee, Y.-J.; Kang, S.-W.; Kim, Y.; Shin, M.; Hong, M.; Seo, E.-K.; Kim, S.-H.; Nah. S.-Y.; Bae,H. Effects of Protostane-Type Triterpenoids on the 5-HT3A Receptor-Mediated Ion Current in Xenopus oocytes. Brain Res. 2010, 1331, 20-2

33、7.Fong, W.-F.; Wang, C.; Zhu, G.-Y.; Leung, C.-H.; Yang, M.-S.; Cheung, H.-Y. Reversal of Multidrug Resistance in Cancer Cells by Rhizoma Alismatis Extract. Phytomedicine 2007, 14, 160-165.Kim, G. S.; Kim, J. K.; Seong, J. D.; Park, C. K.; Suh, H. S.; Kwack, Y. H. Effects of Cultural Condition on th

34、e Yield and Contents of Effective Components in Alisma orientale (Samuels.) Juzepcz. Kor. J.Med. Crop Sci. 1996, 4 (2), 139-144.Choi, S.-S. The Effects of Alisma Canaliculatum Butanol Fraction with Selenium on Glycogen Level,Lipid Metabolism and Lipid Perosidation in Streptozotocin-Induced Diabetic

35、Rats. Kor. J. Nutr.2004, 37 (1), 15-22.Toh, C.-A. Pharmacognostical Studies on Alisma Plants. Kor. J. Pharmacogn. 1995, 26 (4), 411-418.Makabel, B.; Zhao, Y.; Wang, B.; Bai, Y.; Zhang, Q.; Wu, L.; Lv, Y. Stability and Structure Studies on Alisol A 24-Acetate. Chem. Pharm. Bull. 2008, 56 (1), 41-45.W

36、ang, C.; Zhang, J.-X.; Shen, X.-L.; Wan, C.-K.; Tse, A. K.-W.; Fong, W.-F. Reversal of P-glycoprotein-Mediated Multidrug Resistance by Alisol B 23-Acetate. Biochem. Pharmacol. 2004, 68, 843-855.Kim, K.-L.; Jeong, J.-S. Sensory Characteristics of Doenjang Supplemented with Sage Powder asAssessed by R

37、esponse Surface Methodology. Kor. J. Food Preserv. 2010, 17 (20), 243-249.Shin, H.-H.; Kang, M.-J.; Cho, H.-Y.; Kim, B.-C.; Cho, E.-K. Optimization of Extraction Conditions for Houttuynia cordata Thunb and Saururus chinensis Bail Mixture by Response Surface Methodology.Food Eng. Prog. 2008, 12 (4),

38、247-255.Park, J.-W.; Kim, H.-S.; Park, I.-B.; Shin, G.-W.; Lee, Y.-J.; Jo, Y.-C. Optimization of Ethanol Extraction Conditions from Glasswort (Salicirnia herbacea) Using Response Surface Methodology. Kor. J. Food Preserv. 2009, 16 (3), 376-384.Park, K.-J.; Lim, J.-H.; Kim, B.-K.; Jeong, J.-W.; Kim,

39、J.-C.; Lee, M.-H.; Cho, Y.-S.; Jung, H. Optimization of Extraction Conditions to Obtain Functional Components from Buckwheat (Fagopyrum esculentum M.) Sprouts, Using Response Surface Methodology. Kor. J. Food Preserv. 2009, 16 (5), 734-741.Kim, S.-H.; Kim, H.-K.; Yang, E. S.; Lee, K. Y.; Kim, S. D.; Kim, Y. C.; Sung, S. H. Optimization of Pressurized Liquid Extraction fo