流式细胞术的基本理论

1、第一节流式细胞术的基本理论节概述流式细胞术是一种对悬液中单个细胞或细胞器、质点进行快速测量和自动分析的高新技术。该技术的特点是: 测量速度快，每秒钟能测量上千个细胞，它不仅可以进行多参数相关测量，而且还可以把指定特征的细胞亚群从整 个细胞群中分离出来。本节主要介绍流式细胞仪的光学及工作原理。撅知识点导航工作原理流式细胞仪主要由流动室及液流系统、激光器及光学系统、光电管及检测系统、计算机及分析系统四个部分组 成如图17 1 o图17-1流式细胞仪的工作原理图待测细胞被制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后置于专用样品管中，在气体压力作用下被压入流动室， 流动室内充满鞘液，在鞘液作用下，细胞排成

2、单列，沿液流的轴心一个接一个地从流动室下端的喷嘴喷出，形成细 胞液柱。液柱与高度聚焦的激光束垂直相交，细胞受到激光激发产生荧光信号和散射光信号，这些光信号通过相应 的光电管和检测器被接收并转换成电信号，经放大器放大后送入计算机并进行分析显示和结果输出。光学原理流式细胞仪的光学系统由激光器和若干组透镜、滤光片及小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不 同的电子探测器。其主要光学元件是分色反射镜(DL)和滤光片(filter)，它们一般分为三类：长通滤片(long pass filter， LP)、短通滤片(short pass filter， SP)和带通滤片(band pass filt

3、er， BP)。分色反射镜(488DL、550DL、600DL、640DL)用于选择被测荧光波长，只允许大于特定波长的光通过，而将 小于特定波长的光反射到光电检测器。长通滤片只允许特定波长以上的光通过，特定波长以下的光不能通过。如LP620 nm滤片，只允许620 nm以 上的光通过，而620 nm以下的光吸收或返回。短通滤片与长通滤片相反，允许特定波长以下的光通过，而特定波长以上的光吸收或返回。带通滤片(488BP、525BP、575BP、675BP)允许某一特定波长的光线通过，而其他波长的光全部被阻断。例如，FITC染料发射出525 nm的绿色荧光，PE染料发射出575 nm的橙色荧光，分

4、别选择550DL和525BP组成 的滤片组和600DL和575BP滤片组，即可达到特异地接收FITC和PE荧光信号的目的。光电倍增管和硅光电二极管， 可分别将侧向散射光和前向散射光以及525675等不同的荧光信号收集检测。散射光测量细胞在通过测量区时由于受光照射会向空间360立体角的所有方向散射光线，散射的信号与细胞的大小、形状、 质膜和细胞内部的折射率有关，与收集散射光的方向也有关。在流式细胞术中一般采用0前向散射光(FS)和90 侧向散射光(SS)。前向散射光的强度与细胞大小有关，对于同一个细胞群体，散射光强的细胞大一些，而散射光弱 的细胞小一些。侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为

5、敏感，对胞质内较大的颗粒也有反应，可获得有关 细胞内部精细结构和颗粒性质及膜表面光滑程度的有关信息。图17-2是利用流式细胞仪前向散射光和侧向散射光 测得的全血白细胞二维点图，由图可见，利用FS和SS可将白细胞群中不同细胞群分开，得到很清楚的三群细胞。0 fe 5 5S S 5& ZeFS:前向散射光；SS:侧向散射光图17-2全血白细胞二维点图荧光测量荧光信号有特征荧光和自发荧光两类。特征荧光是指用荧光染料对细胞进行特异性染色，受到光照射后发出的 荧光称为特征荧光。自发荧光是指未染色的细胞，受到光照射后所发出的荧光称为自发荧光。其荧光强弱与细胞的 大小、细胞的类型、激发光的波长和发射光的检测

6、范围等有关，细胞中产生自发荧光的分子可能是核黄素和细胞色 素等。在培养细胞中死细胞比活细胞的自发荧光要强。用流式细胞仪测定细胞的特征荧光时，自发荧光对所测定特 征荧光是一种本底信号，应在设定阴性对照样品时加以去除，同时应尽可能地选用较亮的荧光染料染色细胞，提高 信号/噪声比，以减少自发荧光的干扰，这是在样品处理与测量中应特别注意的问题。荧光补偿：对于双标记或三标记荧光染色的样品，在应用FCM测量时需要对荧光信号的光谱重叠部分进行校正， 当用一束激光激发两种荧光染料，而同时发出两种不同波长的荧光时，从理论上讲，可以通过选择滤片使每种荧光 仅被检测器检测。但由于两种荧光的发射光谱不可避免的重叠现象

7、，在实际测量中当两波长比较接近，如FITC发射 的525 nm荧光和PE发射的575 nm荧光会发生交叉干扰，使被测信号失真，测量结果产生较大的误差，因此须采用 荧光补偿方法来解决这种交叉重叠的问题。目前生产厂家都提供有荧光补偿的实用程序，用厂商指定的488 nm激光 激发的三种荧光染料（FITC、PE、PerCP）,在测量中加以正确补偿即可比较容易达到正确测量荧光信号的目的。测量参数分析（1）单参数直方图分析：是流式细胞术使用最多的一种分析方法，它主要用来分析细胞相对数与测量参数之间的 关系（图17 3）。图17-3是CD3阳性T淋巴细胞的直方图，横坐标代表所测CD3分子的荧光强度（即“荧光

8、道数”）， 纵坐标代表细胞的相对数，进入B门域内的为表达CD3阳性T淋巴细胞的细胞数，阳性率占细胞总数的78.27%，未 进入B门域左侧的为CD3阴性细胞数，占细胞总数的21.8%。coo-rnr图17-3 CD3+T淋巴细胞的直方图双参数直方图分析：多用于一种细胞以两种荧光染料染色而获得两个参数的二维数据的分析，也可用于前向 散射光与侧向散射光围成的细胞二维点图的分析。一般用横坐标代表某一个参数，纵坐标代表另一个参数。图17 -4是同时用双标记抗体CD4 /FITC和91C3/PE染色的细胞，用流式细胞仪测量所得到的双参数直方图。平面上每一 个点表示同时具有相应坐标值的细胞，D1区域为91C3阳性细胞群，D2区域为CD4和91C3双阳性细胞群，D3区域为 阴性细胞群，D4区域为CD4阳性细胞群。4图17-4细胞双参数直方图DNA直方图分析：主要用于细胞周期分析，用该方法可以得到细胞周期中各时相(G0/G1期、S期和G2/M期) 细胞的百分比及DNA含量，以便进行细胞动力学的研究。另一应用是进行细胞DNA倍体分析，以同种属正常二倍体 细胞作对照判定所测细胞属于几倍体细胞。图17-5是用Coultor公司提供的DNA染色试剂盒，染色细胞DNA所获得的DNA直方图。细胞经荧光染色后，其荧光强度与DNA含量成正比。G0/G1期细胞的DNA含量是2C, G2/M细