批改后报告实验12-2b班

1、专业：临床医学 1003：_学号：_3100102445实验日期：_2013 年 3 月 27 日 地点： 生理科学课程名称： 生理科学实验实验类型：探究性实验项目名称：离体心脏的实验研究指导老师：同组学生：to:3100离体心脏的实验研究批注 1:（浙江大学医学院 2010 级临床医学 1003 班，浙江杭州 310058）【摘要】 目的：观察钾、钙离子浓度、肾上腺素、乙酰胆碱对离体心脏活动的影响，探讨其机制。 方法：用 Straub 法进行的离体心脏灌流，分别观察并灌流无钙任氏液、高钙任氏液、高钾任氏液、乙酰胆碱、乙酰胆碱+阿托品、肾上腺素、+肾上腺素的心脏舒张末张力(end diasto

2、lic ten, EDT)、心脏收缩末期张力(end systolic ten,EST) 、心率(heart rate, HR)。 结果：加入 25 L 普通任氏液前脏EDT 无显著变化（0.990.21 g；0.980.21 g；p0.05）；EST 无显著变化（7.223.74 g；7.183.64 g；p0.05）；心率无明显变化（39.007.45 bpm；37.638.02 bpm；p0.05）。无钙任氏液灌流心脏后 EDT1.200.43 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时 EDT 0.800.22 g（p0.05）。Ca2+ 2210-4 mol/L 高钙任氏液作用于心脏后EDT

3、0.760.31 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时 EDT 0.900.29 g（p0.05）；Ca2+ 2210-4 mol/L 高钙任氏液作用于心脏后EST 7.201.90 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时 EST 4.651.78 g（p0.05)。K+ 5.910-3 mol/L 任氏液作用于心脏后EDT 0.970.33 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时 EDT 0.780.25 g（p0.01)；K+ 5.910-3 mol/L 任氏液作用于心脏后 EST 3.601.60 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时 EST 5.042.52 g（p0.05)。910-8 mol/L AC

4、h 任氏液作用于心脏后 EDT0.880.25 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时 EDT 0.810.26 g（p0.01)；910-8 mol/L ACh任氏液作用于心脏后 EST 3.841.95 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时 EST 4.992.44 g（p0.05)。910-8 mol/L ACh +310-6 mol/L Atr 灌流后心脏 EDT 0.750.25 g 显著小于 910-8 mol/L ACh 灌流脏EDT 0.810.24 g（p0.01)；910-8 mol/L ACh +310-6 mol/L Atr 灌流脏EST 4.962.20 g 显著大于910-8

5、 mol/L ACh灌流脏 EST 4.181.85 g（p0.01)；910-8 mol/L ACh +310-6 mol/L Atr 灌流脏HR37.134.45 bpm 显著小于 910-8 mol/L ACh 灌流脏的HR 38.754.43 bpm（p0.01) 。610-7 mol/L Adr 任氏液灌流心脏后 EDT 0.600.28 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时 EDT 0.740.28 g（p0.01)；610-7 mol/L Adr 任氏液灌流心脏后 EST 10.053.82 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时 EST 4.292.25 g（p0.05)。510-6mo

6、l/L Pro+610-7 mol/L Adr 任氏液灌流脏后EDT 0.710.26 g 与 510-6 mol/L Pro 任氏液灌流脏EDT 0.750.24 g 无显著差异（p0.05)；510-6 mol/L Pro+610-7 mol/L Adr任氏液灌流脏后 EST 3.211.04 g 与 510-6 mol/L Pro 任氏液灌流脏的 EST3.251.27 g 无显著差异（p0.05)；510-6 mol/L Pro+610-7 mol/L Adr 任氏液灌流脏后HR 30.208.88 bpm 与510-6 mol/L Pro 任氏液灌流脏的HR 30.709.63 bp

7、m 无显著差异（p0.05）。 结论：心肌细胞外低 Ca2+使心肌收缩减弱，舒张不完全，高 Ca2+反之。心肌细胞外高 K+使心肌收缩减弱，舒张不完全。乙酰胆碱可使心肌收缩减弱，舒张不完全，而阿托品可阻断乙酰胆碱的这一作用。肾上腺素可使心肌收缩增强，舒张完全，而使心肌收缩减弱，且可拮抗肾上腺素的作用。【】离体心脏 灌流 钙离子 钾离子 乙酰胆碱 阿托品 肾上腺素1 材料1.1 实验动物（中华指名亚种，Zhuoshan Toad)，健康，体重 73.70.013 g，雌雄不拘（由浙江大学医学院实验动物中心提供）1.2 仪器 RM6240 生物信号处理系统(RM6240 multichannel

8、physiological recording andprosing system，仪器厂）、JZJ01 张力换能器（仪器厂）批注 2:1.3 药品 610-5 M 肾上腺素（adrenaline hydrochloride）、610 6 M 乙酰胆碱（acetylcholinechloride）、510-4 M（propranolol hydrochloride）、2104 M 阿托品（atropinesulfate）、0.2 M 氯化钾、0.045 M 氯化钙、任氏液（Ringers solution）、无钙任氏液（Ca2+ -freeRingers solution）2 方法2.1 仪器

9、连接和参数 张力换能器接 RM6240 多道生理信号处理系统第 1 通道，RM6240 多道生理信号处理系统采样频率：800 Hz，时间常数：直流，滤波：30 Hz，灵敏度：7.5 g。调零。2.2 离体心脏标本毁脑脊髓，仰卧于蛙板，打开胸腔，心脏，结扎下腔静脉，靠头端结扎左主动脉，在左、右主动脉下穿线，在左主动脉根部剪一斜口，将插管动脉圆锥，在心室收缩时将插管心室，结扎固定，游离心脏。2.3 心脏与换能器连接 将蛙心插管固定在夹具上，用与张力换能器连接是蛙心夹在心室舒张期心尖，调节微调使心脏舒张末期张力至 1 g。2.4 稳定 扫描速度调整为 5s/div。加 1mL 任氏液，稳定 10mi

10、n 以上。试验开始前，如前负荷小于 1g，再调至 1g 稳定。观察项目向插管中加入 1 ml 任氏液，心搏曲线稳定后正常的心搏曲线 45 s。加 25 l 任氏液，心搏曲线稳定后45 s3.2 无钙任氏液 1 ml 替换插管内的任氏液，心搏曲线稳定后45 s。3.3 用任氏液洗脱 3 次，加入 1 ml 任氏液，待曲线稳定 45 s 后，向灌流液中加 0.045 M CaCl2溶液 25 l，心搏曲线稳定后45 s 。3.4 用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入 1 ml 任氏液，待曲线稳定 45 s 后，在任氏液中加 0.2 M KCl 溶液 20 l，心搏曲线稳定后45 s。3.5 将上

11、述溶液吸出，用新鲜任氏液换洗数次，加入 1 ml 任氏液，待曲线稳定后45 s，在任氏液中加 6106 M acetylcholine （ACh）溶液 15 l，心搏曲线稳定后45 s。再加 2104 M atropine（Atr）15 l，心搏曲线稳定后45 s。3.6 用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入 1 ml 任氏液，待曲线稳定 45 s 后，在任氏液中加 610-5 M 的adrenaline（Adr）溶液 10 l，心搏曲线稳定后45 s。3.7 用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入 1 ml 任氏液，待曲线稳定 45 s 后，在任氏液中加 510-4 M propranol

12、o（l Pro）溶液 10 l，心搏曲线稳定后45 s ，再加入 610-5MAdr 溶液 10 l，心搏曲线稳定后45s 。3.8 数据测量 测量各项处理前后的心率（heart rate，HR)、心脏舒张末期张力（end diastolicten，EDT) 、心脏收缩末期张力(End systolic ten，EST)。Excel处理，结果以x s 表示，组间比较采用 t 检验，P0.053.9 统计处理 用认为有显著性差异，P0.05）；EST 无显著变化（7.223.74 g；7.183.64 g；p0.05）；心率无明显变化（39.007.45 bpm；37.638.02 bpm；p0

13、.05）。见表 14.2 无钙任氏液对心脏的影响无钙任氏液灌流心脏后EDT 1.200.43 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时EDT 0.800.22 g（p0.05）。见表 14.3 高钙任氏液对心脏的影响Ca2+2210-4 mol/L 高钙任氏液作用于心脏后EDT 0.760.31 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时EDT 0.900.29 g（p0.05）；Ca2+ 2210-4 mol/L 高钙任氏液作用于心脏后EST 7.201.90g 显著大于正常任氏液灌流心脏时EST 4.651.78 g（p0.05)。见表 14.4 高钾任氏液对心脏的影响K+5.910-3 mol/L 任氏液

14、作用于心脏后EDT 0.970.33 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时EDT 0.780.25 g（p0.01)；K+ 5.910-3 mol/L 任氏液作用于心脏后EST 3.601.60 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时EST 5.042.52 g（p0.05)。见表 14.5 乙酰胆碱及阿托品对心脏的影响910-8 mol/L ACh 任氏液作用于心脏后EDT 0.880.25 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时EDT 0.810.26 g（p0.01)；910-8 mol/L ACh 任氏液作用于心脏后EST 3.841.95 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时EST 4.992.44 g

15、（p0.05)。910-8 mol/L ACh +310-6 mol/L Atr 灌流脏 EDT 0.750.25 g 显著小于 910-8 mol/LACh 灌流脏EDT 0.810.24 g（p0.01)；910-8 mol/L ACh +310-6 mol/L Atr 灌流脏 EST 4.962.20 g 显著大于 910-8 mol/L ACh 灌流脏 EST 4.181.85 g（p0.01)；910-8 mol/L ACh +310-6 mol/L Atr 灌流脏 HR 37.134.45 bpm 显著小于 910-8 mol/LACh 灌流脏的 HR 38.754.43 bpm（

16、p0.01) 。见表 14.6 肾上腺素对心脏的影响610-7 mol/L Adr 任氏液灌流心脏后 EDT 0.600.28 g 显著小于正常任氏液灌流心脏时 EDT0.740.28 g（p0.01)；610-7 mol/L Adr 任氏液灌流心脏后EST 10.053.82 g 显著大于正常任氏液灌流心脏时 EST 4.292.25 g（p0.05)。见表 14.7对心脏的影响510-6 mol/L Pro+610-7 mol/L Adr 任氏液灌流脏后 EDT 0.710.26 g 与 510-6 mol/LPro 任氏液灌流脏EDT 0.750.24 g 无显著差异（p0.05)；51

17、0-6 mol/L Pro+610-7 mol/LAdr 任氏液灌流脏后 EST 3.211.04 g 与 510-6 mol/L Pro 任氏液灌流脏的 EST3.251.27 g 无显著差异（p0.05)；510-6 mol/L Pro+610-7 mol/L Adr 任氏液灌流脏后HR 30.208.88 bpm 与510-6 mol/L Pro 任氏液灌流脏的HR 30.709.63 bpm 无显著差异（p0.05）。见表 155.1 普通任氏液对心脏的影响在 1 ml 正常任氏液灌流下再加入 25 l 正常任氏液，心脏收缩舒张功能及心率均无变化，说明加入液体的体积并不影响心脏功能。从

18、而可以消除无关对实验的影响。5.2 细胞外低钙对心脏的影响心肌细胞动作电位可分为 0 期(去极相期)，1 期(快速复极初期)，2 期(期)，3 期(快速复极末期)，4 期(静息期)。L 型Ca2+通道在膜电位去极化到-40 mV 时(0 期)激活开放，电流幅值到 2 期才达到峰值1，形成 2 期的主要内向离子流。内流的 Ca2+作用于肌浆网上的雷诺丁受体(ryanodine receptor, RyR)，快速与RyR2 上的激活位点结合，使其迅速开放，肌浆网内的大量 Ca2+进入胞浆中，使胞浆内 Ca2+浓度升高约 100 倍（钙诱导钙）1。胞质内钙离子浓度升高，肌钙蛋白 C 结合钙离子后，肌

19、钙蛋白 I 与肌动蛋白的结合减弱，肌动蛋白上的肌球蛋白结合位点，一次横桥周期。肌浆网上的RyR2 除了存在Ca2+激活位点以外，还有启动缓慢而亲和力高的 Ca2+失活位点1。通过 RyR2使收缩期肌浆网 Ca2+的 Ca2+与 RyR2 的 Ca2+失活位点结合，关闭 RyR2，终止 Ca2+，终止，外源性 Ca2+内流停止。心脏舒张开始时，胞内 Ca2+浓度仍高，依靠以下几种机制降低胞浆 Ca2+浓度：肌浆网以及肌膜上的钙泵；肌膜上的 Na+-Ca2+交换；线粒体的单转运体。其中 8090%由肌浆网上的钙泵重新泵入肌浆网内1。无钙任氏液灌流心脏后，EST 显著减小，EDT 显著增大，HR 无

20、明显变化。细胞外 Ca2+浓度降低，通过 L 型钙通道进入细胞的 Ca2+减少，触发肌浆网的 Ca2+也减少，使心肌细胞兴奋时胞浆内Ca2+浓度减小，Ca2+与肌钙蛋白的结合比正常情况减少，心肌收缩减弱，表现为 EST 下降。心室的舒张有以下几方面：心室收缩末期由于心室几何结构的改变产生一种促使心室复位的舒张势能，心室收缩愈好这种势能就愈大，舒张时会越完全。低钙任氏液灌流后，由于心肌收缩力减弱，导致了舒张势能减少，故心肌细胞舒张不完全，EDT增大。由于心肌细胞胞浆内 Ca2+浓度减小，肌浆网钙泵回摄 Ca2+延缓，导致舒张期胞质Ca2+处于较高水平，不利于Ca2+与肌钙蛋白的解离，舒张不完全。

21、胞质内 Ca2+浓度降低，Na+-Ca2+交换体活性降低（其活动主要取决于膜电压和细胞内外的钠、钙浓度3），Ca2+外排减少，导致心室舒张不完全。5.3 细胞外高钙对心脏的影响高钙灌流液作用下，EST 明显增加，而EDT 明显减小，HR 明显下降。高Ca2+环境下，膜内外钙离子的浓度差加大，通过 L 型钙离子通道内流的钙离子加快并增多，刺激肌质网Ca2+增加，胞浆内钙离子浓度显著升高，兴奋收缩耦联作用增强，故 EST 增强。由于心肌收缩增强，使得舒张势能增大，心室可以充分舒张，故 EDT 较正常时显著性降低。同时由于胞质中Ca2+浓度高于正常值，钠钙交换体活性增强，肌浆网钙泵转运效力也增强，胞

22、质中的 Ca2+能迅速有效降低，成为心室舒张完全的另一原因。5.4 细胞外高钾对心脏的影响实验结果显示，K+ 5.910-3mol/L 任氏液灌流后， EDT 显著增大， EST 显著减小，表明心肌细胞外K+浓度升高使心脏产生负性变时和变力作用，即心肌收缩减弱，舒张不完全。批注 3: 依据当心肌细胞外K+浓度增高时，一方面使心肌细胞静息电位变小而接近阈电位，这可抑制 Na+通道的通透性, 使快反应细胞动作电位 0 期除极速度和幅度下降，心肌兴奋性降低。另一方面，细胞外 K+和 Ca2+存在互相竞争抑制关系，K+浓度升高时，可以使钾电导增大，细胞膜对 K+的通透性增加，并可抑制心肌动作电位复极化

23、 2 期Ca2+内流，因而使心肌兴奋-收缩耦联作用减弱，心肌收缩力降低1。由此，实验结果中 EST 降低明显减小。由于期 Ca2+内流减少，使收缩后胞内 Ca2+浓度较低而抑制了钠钙交换的 Ca2+外排，造成 Ca2+潴留以及收缩储备的势能减小，另外，严重高钾时静息电位升高至超过阈电位，导致心肌兴奋性1。所以本次实验的结果证明了本次采用的是轻度高钾环境。5.5 Ach 和 Atr 对心脏的影响乙酰胆碱作用于心肌细胞膜上的M 型胆碱能受体，通过G 蛋白使腺苷酸环化酶抑制，降低细胞内 c水平，进而降低蛋白激酶A 活性，发挥了负性变时变力作用。其负性变时作用主要原因：激活 ACh 依赖的 K+通道，

24、增加 K+外流，引起最大复极电位增大；P 细胞 4 期 If 减小；激活一氧化氮合酶，使细胞内cGMP 水平升高，从而降低 Ca2+通道开放的概率，Ca2+内流减少，导致P 细胞阈电位水平上移；从而导致P 细胞自律性降低，使心率减慢。本次实验中虽然心率有显著性差异，但处理前后 HR 实际变化并不大，故此显著性差异是否有意义值得商榷。其负性变力的主要原因是肌质网和细胞入心肌细胞胞质的Ca2+减少（c降低引起肌质网Ca2+减少，cGMP 增高引起 Ca2+内流减少），胞质中 Ca2+浓度降低，因而收缩力减弱；另一方面，复极化时 K+外流加速，导致期缩短，每个动作电位进入胞质的 Ca2+减少，收缩力

25、减弱1。阿托品为M 受体拮抗剂，它与M 胆碱受体结合后，由于其本身内在活性小，一般不产生受体激动作用2，又因为其阻断了乙酰胆碱与 M 受体的结合，因此拮抗其负性变时变力作用。5.6 Adr 对心脏的影响肾上腺素作用于心肌细胞膜的肾上腺素能受体，从而激活腺苷酸环化酶，使细胞内 c的浓度升高，继而激活蛋白激酶和细胞内蛋白质的磷酸化过程，使心肌膜上的钙通道激活，故在心肌动作电位期 Ca2+的内流增加，细胞内肌质网的 Ca2+也增加，其最终效应是心肌收缩能力增强，EST 上升。增大的舒张势能使得心肌舒张充分，同时肾上腺素还能促使肌钙蛋白对Ca2+的，加速肌浆网对Ca2+的摄取，故能加速心肌舒张，EDT

26、 下降。5.7 Pro + Adr 对心脏的影响批注 5:批注 4: 依据Propranolol 属无内在拟交感活性的受体阻断药2，其本身具有生物学活性，可阻滞钠通道、促进钾通道、缩短复极过程。Propranolol 作用于心肌时，心肌动作电位复极化时程缩短，钙离子内流减少，触发的肌浆网的钙离子减少导致兴奋收缩偶联减弱，心肌收缩力降低。同时，由于收缩期胞浆钙离子浓度的降低，造成钙离子潴留在胞浆内，心肌舒张。由于propranolol 可阻断受体，故再灌流 Adr 溶液时，心肌收缩与舒张情况无显著改变。由此表明，肾上腺素对心肌的正性肌力作用由 肾上腺素受体介导。5.8 各处理对于心率的影响本实验

27、离体心脏灌流采用 Straub 法，心脏插管由动脉圆锥进入，破坏瓣。心脏起搏点为静脉窦，位于心房后方，只有当灌流液通过破坏的瓣返流入心房之后，才会明显影响心脏自律性。所以实验过程中心率几乎没有显著性差异。5.9 误差分析本次实验某些小组个别数据存在异常而舍去，分析原因：心率显著偏小：可能手术操作过程中损伤或结扎静脉窦，改变心脏自律性引起非窦性心律；心脏插管过程中，如果并非在心室收缩期将插管心室，可能破坏瓣，导致灌流液进入心房，直接作用于静脉窦，而直接影响心脏活动；在换灌流液进行洗脱时，心腔内仍会残留之前的部分溶液而无法彻底洗脱干净，由此也会引入误差；未等待曲线稳定便停止，尤其是普罗灌流时应等待

28、其与心脏充分作用后再加肾上腺素；实验手术过程中，各组在结扎心脏以及心脏插管等过程中对心脏造成了不同程度的损伤，导致灌流过程中心脏可能出现心律不齐或者心脏低下等情况，不同程度地影响了实验结果。6 结论心肌细胞外低 Ca2+使心肌收缩减弱，舒张不完全，高 Ca2+反之。心肌细胞外高 K+使心肌收缩减弱，舒张不完全。乙酰胆碱可使心肌收缩减弱，舒张不完全，而阿托品可阻断乙酰胆碱的这一作用。肾上腺素可使心肌收缩增强，舒张完全，而使心肌收缩减弱，且可拮抗肾上腺素的作用。参考文献1.生理学.第 2 版.:人民卫生,2010.109-120 123-124 140-1432主编.药理学.第 2 版.:人民卫生,2010:57 69-72 81-84 94-99.3,吴玉林.钠钙交换体及其抑制剂在心律失常中的作用.中国临床药理学与治疗学,2006,11(6):610.摘要中的结论是实验结果。中，综合性论述标注。注意格式规范。中的关键论据或观点应有请对批注部分进行思考。本次实验的综绩为 8 分2013-6-13附录表 1 Effects of adrenaline,cetylc