人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响

1、人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响【摘要】 目的 探讨人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织c-jun N-末端激酶（pJNK）表达的影响及其意义。方法将大鼠随机分为假手术组、单纯缺血再灌注组、人参皂甙Rg1 10、20、40 mg/kg组、尼莫地平1 mg/kg组，采用大脑中动脉闭塞法建立脑缺血再灌注模型,应用免疫组织化学方法检测脑组织缺血再灌注4h后pJNK的表达。 结果 人参皂甙Rg1各剂量组大鼠脑组织pJNK表达阳性率分别为(23.896.77), (15.194.59), (9.154.77)，均低于单纯缺血再灌注组 (27.158.46)。结论 人参皂甙Rg1防治大

2、鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与抑制脑组织pJNK表达有关，且以高剂量效果较好。 【关键词】 人参皂甙Rg1 脑缺血再灌注 pJNK 大鼠Abstract: Objective To discuss the effects of Ginsenoside Rg1 on the expressions of JNK in the rats brain tissue after focal cerebral ischemia-reperfusion and its significance. Methods Rats were divided into the sham-operative group

3、, Model group, Ginsenoside Rg1 groups of 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40mg/kg, and Nimodipine group of 1 mg/kg at random. The method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats was adopted to establish the model of cerebral ischemia-reperfusion, and then the expressions of JNK after cerebral ischemia-

4、reperfusion 6 h was tested based on the chemical method in immunity tissue. Results The positive rate of expression of rats brain tissue in each of the Ginsenoside Rg1 groups is (23.896.77), (15.194.59), (9.154.77) respectively. Conclusions The results showed that the mechanism of Ginsenoside Rg1 to

5、 protect the brain cells from damage after cerebral ischemia-reperfusion injury may be associated with JNK expression to inhibit brain tissue, and it was more effective when Ginsenoside Rg1 was in high-dose Key words:Ginsenoside Rg1; cerebral ischemia-reperfusion; JNK；rat研究表明，人参皂甙Rg1能通过抑制细胞凋亡对脑缺血再灌注

6、损伤发挥保护作用，但其抗凋亡的机制还不十分清楚1。丝裂原蛋白激酶信号通路(mitogen activated protein kinases，MAPKs)是脑缺血再灌注损伤中主要的信号通路，它包括5个亚家族，其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)亚家族主要参与细胞凋亡的调控。本实验拟采用免疫组织化学方法检测脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区神经元pJNK的表达，并观察人参皂甙Rg1对pJNK蛋白表达的影响，以明确人参皂甙Rg1是否通过JNK信号通路来抑制脑缺血再灌注后的神经元凋亡。 1 材料与方法1.1 实验动物分组与给药方法 Sprage-Daw

7、l大鼠，雄性（以排除雌激素影响），体重为250300 g，随机分为6组：假手术组；单纯缺血再灌注组；人参皂甙Rg1给药组（10、20、40 mg/kg）；尼莫地平药物对照组（1 mg/kg）；每组5只大鼠。组分别于术前5 d至取材当日腹腔注射人参皂甙Rg1、尼莫地平，其余各组分别注射等量等渗生理盐水，1 次/d。1.2 药品及试剂 人参皂甙Rg1(纯度95%)购自吉林大学有机化学教研室；尼莫地平注射液(批号为071001)，购自山西亚宝药业；其它药品均为国产分析纯，由辽宁医学院科学实验中心提供。1.3 大鼠右侧局灶性脑缺血(MCAO)模型的制备 10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，采

8、用改良线栓法2制备大鼠局灶性脑缺血模型。线栓采用头端光滑烫圆的直径0.23 mm鱼线，长度由右侧颈外动脉分叉部计约（18.50.5）mm。栓塞2 h后，将鱼线轻轻拔出并缝合皮下筋膜及皮肤，即为再灌注模型，再灌注时间为4 h。1.4 免疫组织化学染色及图像分析 MCAO术后6 h，将各组大鼠麻醉，4% 多聚甲醛灌流固定，断头取脑，梯度酒精脱水，定向石蜡包埋切片，厚5 m。切片常规脱蜡至水，免疫组化Envision法染色：3% 过氧化氢溶液处理15 min以去除内源性过氧化物酶；然后采用pH6.0 枸椽酸缓冲液高压修复抗原，自然冷却至室温后；滴加1200 稀释的pJNK单克隆抗体4 孵育过夜；然后

9、滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体（PV6001）37 孵育30 min。每步骤之间用0.01 M PBS洗3 次，每次5 min。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。阴性对照用PBS替代一抗2。pJNK蛋白阳性定位于神经元的细胞核，呈棕黄色。 采用CIAS-1000 型细胞图像分析系统进行阳性细胞计数。每例标本等间隔选取切片3 张，每张切片随机选取右侧海马CA1区2 个不重叠高倍视野(400 倍)，计数每个视野下细胞总数及阳性细胞数量，计算表达阳性率=（阳性细胞数/细胞总数）%3。1.5 统计学分析 应用SPSS10.0软件分析，所有数据均用s表示。多组间差异显著性检

10、验采用单因素方差分析及两两比较的q检验。 2 结果2.1 pJNK蛋白免疫组织化学定性、定位表达 假手术组大鼠大脑右侧海马CA1区偶见神经元胞核染色；单纯缺血再灌注组可见大量阳性细胞，与假手术组比较有显著差异(P0.05)；人参皂甙各组和阳性对照药尼莫地平组能显著降低MCAO大鼠海马CA1区的pJNK阳性细胞数，与单纯缺血再灌注组比较有显著性差异(P0.05)；人参皂甙Rg1 10、40 mg/kg组与阳性对照药尼莫地平1 mg/kg组比较均有显著性差异(P0.05)，见表1，图1。表1 各组大鼠MCAO术后6h右侧海马CA1区pJNK表达阳性率比较（略）注：与假手术组比较，aP0.05；与单

11、纯缺血再灌注组比较，bP0.05；与尼莫地平1 mg/kg组比较，cP0.05；与人参皂甙Rg1 10 mg/kg组比较，dP0.05；与人参皂甙Rg1 20 mg/kg组比较，eP0.05 3 讨论 研究表明，脑缺血时组织低氧可使细胞发生坏死或凋亡。JNK家族是MAPK家族成员之一，与细胞凋亡有密切联系4。不论是短暂性还是永久性缺血损伤，JNK信号转导通路在神经元中都被激活，从而发挥重要的作用5-6。Wang ZQ等利用大脑中动脉永久栓塞(MCAO)模型，证实脑缺血或缺血再灌注后损伤中心脑区JNK的激活主要在损伤后30 min6 h，以神经元为主，在损伤中心区和半暗带区磷酸化的JNK显著增多

12、7-8。 JNK主要表达于胞质内，核内也有少量表达。JNK一旦被激活，称为pJNK，立即从细胞质移位至细胞核，并可引起级联反应，导致其一些作用底物相应激活。首先，pJNK通过对c-Jun氨基末端63与73位的丝氨酸进行有效的磷酸化而激活c-Jun。活化的c-Jun可以聚合成二聚体而形成可以活化的蛋白-1(AP-1)复合物，这种复合物通过与其靶DNA结合相结合激活下级基因而发挥其抗凋亡作用9。 本实验结果显示：假手术组有少量pJNK阳性细胞；与假手术组比较，单纯缺血再灌组大鼠海马CA1区神经元可见大量pJNK阳性细胞，差异有统计学意义(P0.05)，这一实验结果与以往文献报道基本一致；人参皂甙R

13、g1三个剂量组与单纯缺血再灌注组比较，pJNK的表达明显减少，提示人参皂甙Rg1具有抑制脑缺血再灌注大鼠pJNK的作用。人参皂甙Rg1 各组分别与阳性对照药尼莫地平组比较，人参皂甙Rg1 10 mg/kg组虽能抑制神经元pJNK的表达，但与阳性对照药尼莫地平组比较仍显著性差异(P0.05)，此结果提示人参皂甙Rg1中、高剂量组的效果在抑制pJNK蛋白表达方面具有与尼莫地平相似的效果。本结果提示人参皂甙Rg1具有抑制pJNK蛋白表达的作用，但其能否通过抑制JNK信号通路减少脑缺血再灌注损伤引起的神经元凋亡，以发挥其对缺血性脑损伤的保护作用尚需进一步证实。【参考文献】 1 王海波，李源莉. 人参皂

14、甙Rg1神经保护作用的研究进展J. 白求恩军医学院学报，2008，6（5）：291-293.2 张铭,司少艳,韩瑞刚，等.免疫组化SP法与PicTureTM两步法的比较J. 诊断病理学杂志，2004,11(1):58-59.3 王凤岩,夏潮涌. 组织原位肿瘤细胞DNA含量与倍体分析的某些方法学问题J.中华病理学杂志，2000,29(5):381-382.4 Farrokhnia N, Roos MW, Ternt A，et al. Differential early mitogen-activated protein kinase activation in hyperglycemic is

15、chemic brain injury in the ratJ. Eur J Clin InvestJ. 2005，35(7):457-463.5 Ginet V, Puyal J, Magnin G, et al. Limited role of the c-Jun N-terminal kinase pathway in a neonatal rat model of cerebral hypoxia-ischemiaJ. J Neurochem，2009,108(3):552-562.6 Borsello T, Clarke PG, Hirt L，et al.A peptide inhi

16、bitor of c-Jun N-terminal kinase protects against excitotoxicity and cerebral ischemiaJ.Nat Med，2003，9(9)：1180-1186.7 Repici M, Centeno C, Tomasi S, et al. Time-course of c-Jun N-terminal kinase activation after cerebral ischemia and effect of D-JNKI1 on c-Jun and caspase-3 activationJ. Neuroscience，2007,150(1):40-49.8 Ferrer I, Friguls B, Dlafo E, et al.Early modifications in the expression of mitogen-activated protein kinase(MAPK/ERK),sterss-activated kinases SAPK/JNK and p38,and their phosphorylated substrates following focal cerebra