免疫组库检测的优势和科普知识

1、我觉得我们的技术因为扩增覆盖面大（敏感性强）而且扩增是半定量的，不会因为扩增引起 免疫组库测序偏向，而且还能避免B细胞的hypermutation引起的扩增失败，所以在技术上 我们还是有很多优势的Stanford诺贝尔得奖者Andrew Fire他们组的论文在Translational Medicine上面发表；加拿 大一组科学家在Robert Holt领导下也发表了免疫组库测序的文章；更早还有Quake组对 Zebrafish抗体做高通量测序的文章研究疫苗，我觉得关键问题就是搞懂免疫记忆：免疫记忆是如何形成的？用什么方式记录？ 记录在那里？如何回顾这个记忆？我们不妨这样随想一下：假设体内的免

2、疫系统是由我来掌管的部队，遇到一个可能反复入侵 的敌人，我该如何制订防范计划？免疫记忆，应该是把反抗入侵的成功经验记录下来。这样，当这股敌人再次入侵时，我就可 以用预先准备好的方案去对付他们了。那么，都有什么信息是需要记录下来的？重要的信息应该有敌人的入侵的部位（呼吸道），入侵的敌人量（病毒或者细菌量），敌 人的主攻方法，他们的兵器；上次“反扫荡”我们所用的兵力（动员免疫资源的程度），兵 种（T细胞，B细胞等等），火药配备（IgG? IgA? IgM?），友军（比如先天免疫系统的参 与等），抗击时间和出兵的时机，运兵路线，粮草等。那么，人体（动物）的免疫系统又是如何记录这些信息的？是否也要考虑

3、到这么多的方面？ 这么复杂的“作战计划”是如何储存在免疫记忆中的？又是如何被完美地回招出来的？记忆 又是如何保存而不被忘记的？记忆的空间是否有限？记忆的时间是否有限？教科书上讲的Response to antigen recall部分很笼统，这里面还有很多细节是我们所不知道 的。那么，从大的方面看，教科书上的假说都正确吗？我们看到的数据有那些是和教科书相 符的，那些又是不符的？不符的如何解释？是修改原先的假说还是另外提出假说？当我们手头掌握了只有少数人才有的工具（免疫组库高通量测序技术）的时候，就好比站在 一望无际等待收割的麦田边，启动了大型全自动收割机，等待收获的喜悦的时刻。因为我们 看到的

4、数据量之大，之全，之广是前人梦寐以求的。这是我们的幸运，也是我们的责任。 许多疫苗都属于所谓的减毒活疫苗：如麻疹减毒活疫苗、甲型肝炎减毒活疫苗、乙型脑炎减 毒活疫苗、风疹减毒活疫苗、口服脊髓灰质炎减毒活疫苗、口服狂犬病减毒活疫苗等。这类疫苗的好处就是接种者能获得长期或者终身保护作用，不过安全性是个问题。有人猜测，减毒活疫苗效果好的原因可能是它更贴近野生型病毒的感染进入途径，所以所刺 激出来的免疫反应也更完整，全面，完美。而用合成蛋白作为抗原的疫苗不能有效地挑起 机体完整的免疫反应，所以不是产生出来的士兵兵种不对（该产生分泌型的IgA结果产生出 了 IgG）,就是把训练出的士兵送到了错误的战场（

5、呼吸道疾病的抗体送到消化道去了）。或 者是军区之间步调不协调（T细胞，B细胞，和先天免疫的一些功能细胞之间的协调不够好）。最近和一个CDC的资深科学家交流，椐她说HPV患者中很多血清中有很高浓度的抗HPV抗 体，但是还患宫颈癌；而有些没有很高的抗体浓度，反而不得癌。所以单纯衡量是否有特异 性抗体产生并不说明疫苗就有效。疫苗是很奇妙的东西，可是如果我们在仿效自然免疫的过程中对自然现象本身了解不够，很 可能把事情搞糟。疫苗研发实际上是个“黑匣子”，到底那个好，为什么好，真样才能更 好，我们都不很清楚。这样下去实际上是很危险的。玩免疫系统就好比玩火，或者是倒卖军 火，搞不好会引火烧身的。改进现状需要

6、我们有更好的方法观察体内免疫的变化过程。这是免疫组库技术的一个很重要 的应用方向：通过高通量测序，比较使用疫苗前后的免疫组库变化，能更准确地找到特异性 的个体变化，为评价疫苗的效率提供新的参照指标。研发疫苗就是最大限度地复制机体本身的免疫反应，不但要“山寨”一把，还要做出“高仿” 的产品来。可是我们现在连原版的东西都没有看清楚，如何做出像样的“高仿”产品来呢？我现在做的免疫组库方面的研究和肿瘤关系密切。肿瘤其实就是免疫系统的失职，让该死的 死不了。关键是如何找到失职的机制和责任者，找到了，就有办法治疗了。和许多免疫相关的疾病一样，个体性及强，所以期待的治疗也应该是个体化的。免疫系统是人的内环境

7、和自然的外环境相互作用的界面，它每天要处理的信号不下于神经系 统。它时刻都在问“是敌人，还是朋友？”，“是昨天的朋友？还是昨天的敌人？”，“是 现在的危机，还是今后的隐患？新发现的免疫调控T细胞（regulatory T cells）就是很好的例子。表达太多容易生癌，太少容 易生自身免疫疾病。免疫系统简直就是矛盾的完美组合。自身免疫疾病顾名思义就是自己的免疫细胞六亲不认攻击自己。问题可能被分为两个方面：（1）免疫系统没有问题，是组织细胞发生了变化，使得原本是 “自己的”变成了 “他人的”；（2）免疫系统的敌我识别能力出错，把本来属于自己的当 做他人来攻击。（又是用中医的阴阳理论了，看来用惯的东

8、西还是顺手）。如果是第一种情况，免疫细胞在“培训”阶段所接受的“教育”是好的，这个教育使得它们 具备识别敌我的能力。之所以发生自身免疫反应是因为某些组织细胞本身发生了变化，使得 免疫细胞看花了眼。病毒感染就可以挑起这样的反应。免疫细胞在发生的过程中都经过识别自我的“培训”，一般经过两个严格的挑选过程:先是 识别MHC分子（个人身份证），然后识别一些主要的自身抗原（单位工作证明）。前一个 选择叫“正选择”，把那些符合条件（能和MHC分子结合，但结合力又不很强的）的细胞 选出来；后一个选择叫“负选择”把那些符合条件（能和自身抗原结合）的剔出去。这样选 择的结果是免疫细胞同时看到两个证明（身份证和工

9、作证）时就认为是自己人，放行;但如 果只有一个证明，就要提高警惕了。在上面提到的第一种自身免疫疾病情形下，病人的组织细胞拿不出两个证明，结果被打了; 而另一种情形则是免疫细胞识别证明的能力出了问题，结果当然是敌我不分了。今天我们请来阿拉巴马伯明翰大学的Harry Schroeder教授做学术讲座。Harry是免疫组库方 面的专家，在这个领域工作了二十多年，主要研究抗体组库，因为IgH要比T细胞受体简 单些，没有MHC的参与。Harry也是把免疫组库比喻成Homeland Security Department，认为人的免疫组库有一定的容 量，在这个总容量下质量也很重要。因为它是学遗传出身的，所

10、以用许多遗传学的概念。他的演讲让我想起一个事：人在得了细菌感染以后，需要八天到十天才能产生出有针对性得 抗体。而且这个抗体的生产过程是严格调控的，根据细菌的毒性，入侵细菌的数量，种类， 产生不同程度和种类的免疫反应。这个精密的调控系统十经过成千上万年进化成熟的。可是， 五十年前，人类制造出了抗菌素。通常，感染三五天的时候病人可能就用了广谱抗菌素了。 用药的结果是细菌在体内的数量急剧下降（如果抗菌素有用的话），这是好的方面，可是， 那进化来的周密的调节机制就“失算”了。等按照自然机制产生出抗体的时候，细菌可能已 经从体内被清除了。这就象发生了边境冲突，军委根据情报派兵从北京赶到边境，可是等兵 到

11、了预定战场的时候敌人已经被消灭了。那这些兵如何“裁减”？所以是否可以有这样的假说:有些自身免疫疾病或过敏等免疫失调病的起因可能是抗菌素？ 因为抗菌素的使用破坏了进化成熟的人体免疫机制，“裁军”不及时，导致“兵变”？毫无疑问，抗菌素的发现给人类带来无限的好处，但是如果使用不当也会带来许多问题。除 了能导致细菌耐药性的产生以外，抗菌素滥用还可能引起不必要的副作用甚至产生出其它的 疾病。免疫是一个内外防御体系的平衡：对外要抗击感染；对内要监视突变。对外太强则为炎症; 对外太弱则有慢性感染。对内太强则产生自身免疫；对内太弱则产生癌变。感染和癌症都 是（自己和外来）组织细胞的增生；而自身免疫和炎症则是不

12、必要的细胞损伤。而且，这 个内外防御体系还受“预算”的限制，人体投入在免疫系统的就是那么多资源。如果那个 方面过渡使用了资源的大部，就会产生不平衡，免疫系统的不平衡就会表现为各种临床症 状。那么，如何判断一个人的免疫系统是否处于平衡的正常状态？我们现在的理解是正常的免 疫系统表现之一就是有完好的多样性：有足够多种类的B或T细胞。因为我们的基因组库 技术可以用高通量的手段观察免疫细胞的多样性，因此我们可以很全面的观察和描述个体 的免疫功能状况。当然，免疫系统的失衡也就能够看到了。我们的技术是几个技术的最佳整合：（1）过去二十年免疫学的最高级技术：单克隆抗体和 流式；（2）过去二十年分子生物学的高

13、端技术：多重PCR和高通量测序；（3）加上过去 二十年信息技术的最新发展；生物信息分析软件和高速运算能力的硬件。谢谢您考虑我们题为High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamic interrelationships among human T cell subsets.的 论文。这个研究中，我们结合一个独特的，半定量多重PCR技术和454高通量测序平台来研究T 细胞组库。我们实验室研发出了这个独特的PCR技术并在最近几年对它进行了不断改进和 完善而且用它解答一系列重要的生物学问题。从一个人体分离出的T细胞中我们得到

14、一百六 十七万多有效序列，包括进一百五十万独特CDR3序列这要比基因库（GenBank）中现有 的序列多出进三百七十倍。深入分析测得的序列使我们对T细胞免疫组库的大小做了更精确的推测。同时，我们的数据 也支持有关T细胞命运的“随机假说”。对分离出的T细胞亚型进行高通量测序还使我们能 给T细胞之间的动态功能联系进行详细描述。实际上我们已经完成了更多测序工作，包括B细胞抗体组库和几个病人的免疫组库研究。我 们会慢慢把相关论文写出来。外面听到不少传言，说至少有两个诺贝尔获奖者也在做有关454测序免疫组库方面的工作。 这也是我们加速完成论文的原因之一。不过我对我们独特的“半定量多重PCR”在这方面应

15、用的优势还是比较有信心的。因为有这个技术，我们才能直接研究人的免疫组库。研究人的免疫组库有几大难关：（1）人的免疫细胞来源有限。外周血里十毫升血含有大约五百万B细胞，两千万个T细胞。 考虑到免疫细胞的多样性，十毫升血里面可能每个独特的B或T细胞可能仅有几个。因此不 扩增就没有办法研究。（2）一般的扩增办法不能同时多成千上万个靶点进行扩增，而且扩增会偏向与几个克隆而 忽略其他。所以研究免疫组库的扩增方法需要覆盖面非常广，敏感性格外强。（3）扩增过程不能引入偏向性。不能有些CDR3得到更多的扩增。就是说扩增需要半定量。总结上述难点，就是说研究免疫组库一定需要PCR扩增，扩增需要包容性（敏感性和特异

16、 性）而且需要半定量。除了 arm-PCR以外，能够达到这些要求的扩增技术还没有听说过。另外，与其说这是一个分子免疫学的工作，还不如说这是一个IT项目。背后的信息处理和 分析，储存都靠最先进的技术和专门开发的软件。我现在经常考虑的问题是如何简化这个技术，使它更适合临床使用。因为按现在的方法实在 太贵，太复杂。这段时间一直在想能否不用454测序就能做免疫组库方面的分析工作？因为我们已经发现 许多病人，包括自身免疫和肿瘤病人，他们的免疫组库在多样性方面有明显缺陷。测序虽然 信息量大而且准确，但是每个测序反应目前都需要至少一个星期，耗资两万美元，这就严重 地限制了这个技术的临床应用。昨天我想到了一个

17、方法可以让我们用iCubate生产的仪器设备，在几个小时内得到我们需要 的免疫组库多样性方面的信息。虽然没有测序得到的信息那么直接，但是可以把测序研究得 到的“Disease signature”便捷地检测到。价格也下降到一千美元左右。待我们申请了专利以后就可以和大家分享这个技术的细节了。这里记录一下这个发明的时 间。一个发明是否能得到专利保护取决于三个条件：新颖性（第一个），不明显性（不是一 目了然谁都能看到），和实用性。这个发明显然满足了以上三点。这个发明过程再次体现了我以前总结的“创新方程式”：发现需求一发现难点一解决难 点一满足需求。这里所说的需求就是一种简单，快速，价格便宜的免疫组库

18、多样性检测方法。难点是高通量 测序。就是不经过克隆，直接对PCR混合物进行序列分析。而且我们所要分析的是变化无 穷的免疫大分子。所以这个难题不是那么容易就能解决的。如果没有类似的发明创造，免疫组库（高通量测序免疫大分子）研究就只能停留在科研院校 的高端实验室里。把这个技术从实验室里解放出来，才能真正造福人类。最近自然杂志文章报道，通常用来做免疫抑制剂的雷帕霉素（Rapamycin）能延长老鼠寿命。我觉得这不在意料之外。用我经常做的比喻：免疫系统好比国土安全部，管对外防入侵，对 内防政变和颠覆。任何“健康”的国家都有大笔经费用在维护安全上。用免疫抑制剂来延长 寿命，就好比大幅度裁军，减少国防和国

19、安预算，把原来“浪费”在国防上面的经费从新分 派。这在“和平”环境下当然没有问题，但是一旦内政外交受到挑战就会暴露出风险。把老鼠关在笼子里而不是放在常规环境中来做这个试验，就好比给它们认为地创造出了一个 “和平”环境，然后比较那些有备战支出的和没有备战的部队的生存力。合理使用资源，就是“中庸”的概念：不能无条件削减国防经费，又不能过渡地，不平衡地 把大笔经费投入到某个兵种。合理地维护免疫细胞的多样性才是长寿的真谛。It is a difl ere nt kind of sequencingGWAS & GenomeiRSeqCase-controlCase-controlRe-sequenc

20、ng of public genomesDe novo sequencing ot private repertoires1M SNPs/genome?Repertoire universeThe genome fs sia-icThe immune repertoire is dynamicStudy genotypeStudy pnenotype (env ronnentiStudy physiologySludy pathologyGoa is to identify pathwaysGoa is to identify bicinarkersPredict future disease

21、 risksAsses current health end disease statusResearch toolCfinical toolComnion variants (al DNA leve-), cominon diseasesCommon Ji引明su, corTim：;-! iligens (a) protein level). shared CDR3el两者都是通过比较病人群体和正常对照组来寻找疾病信号；遗传学是反复测己 知的基因组找突变，而免疫组测序每个标本都不同；遗传学研究基因组大小，SNPs 数目都是固定的。免疫组则未知；基因组生下来就不变了（体细胞突变除外）， 免疫组

22、则每天都在更新；遗传学研究的是基因型，免疫组更接近表现型；遗传学 研究偏重生理，免疫学则注重病理（不是病免疫系统就不关心）；遗传学研究 是突变和代谢途径的关系，免疫组的研究目的是寻找可以帮助诊断的生物标记 物；遗传学研究的结果可以用来推测未来患某种疾病的可能性，免疫学则研究 今天的健康和疾病状况；遗传学研究是一个很好的基础科研工具，免疫组研究更 接近临床。所有这些差别实际上都是因为两者几本假设的不同：遗传学认为所有表现型（疾 病）都有相对应的基因型改变，所以疾病诊断信号可以在基因组中找到；而免疫 组研究则认为所有疾病都有相关抗原表达变异，所以可以通过查特异性T或者B 细胞受体来诊断。诊断健康有

23、什么用？有，用途大着呢。因为只有诊断疾病才能治疗疾病；同样， 只有诊断健康才能维持健康。Healthcare 不是真正的在 take care of health, 而是专注于 take care of sickness.所有国家花在治病上的都钱远远多于花在防病上的 钱。为什么一定 要等到有病了才去治疗？为什么没有更好的防病措施？道理很简单：因为我们只 会诊断疾病，不会诊断健康。没有诊断健康的客观指标，任何防病措施的效率就 都无法评估，也就妨碍了整个预防医学领域的发展。因为有中医理论的影响，中国人的防病意识要比西方人强很多。但是“预防为主” 的中医理念近年被各种保健品广告淫逸得差不多了，渐渐在

24、失去魅力。如果有一 个客观指标来衡量到底是否有“增强免疫力”的功能，那消费者是否更容易接 受？还有，国内“健康体检”业蓬勃发展，但是所有机构都只能对有限的一些疾 病进行筛查，并没有很好的评估客户的健康水平，假阳性率高居不下，“健康体 检”也变成了“惊吓体验”。如果有一个客观的指标，让客户看到通过锻炼身体 和改善饮食，自己的健康指数比以前有所改进，这样的检测你是否愿意做？其 实，同一个标本，同一个实验，各种疾病也能得到检测，这是后话。有了这个检测指标，我们对健康的定义就有了延伸：从“没病就是健康”，到“抵 抗力好就是健康”。我们总是把健康和疾病放在一起看，健康就是不生病，生病就是不健康。其实，把

25、这两个概 念分开分析可能很有必要。健康是一种经常的身体状态，健康人也生病，但是得了病很快就好。把一个有先天免疫缺陷的病人放在一个完全隔离的环境下，他也可以保持不生病，可是我们 不能说他就是健康的。所以说，健康人应该有比较完善的免疫系统，能够对付任何内忧外患，外御感染，内防突 变。生病可以是好事，小病不断，大病不犯。免疫系统就需要经常性的练兵。保持健康，就需要保持一个平衡的，有潜力的，能随机应变的，多样化的免疫系统。而相 反，病态，就是免疫系统失去了应有的平衡和多样性。如何诊断健康？如何识别疾病？是否也能从观测免疫系统的“备战”情形得到相关信息？这，就是我们做免疫组库高通量测序的目的。免疫系统对体内的