纤维素酶活力的测定

1、生物产品检验技术课程羊元教学设计卡一、教案头课程单元纤维素酶活力的测定授课对象生物技术专业单元学时2授课教师授课地点.授课时间.教 学 目 标能力（技能）目标知识目标素质目标掌握紫外分光光 度法测定的纤维素酶 活力的操作流程；掌握酶液、底物母 液、缓冲液的配制方 法；熟练分光光度计的 使用方法；能够精确完成葡萄 糖标准曲线绘制；酶活力的计算。掌握CMC法测定纤维 素酶活力的原理；掌握CMC法测定纤维 素酶活力的方法；养成认真主动学习的 习惯；能掌握常用仪器的使 用和保养方法；养成完成实训后及时 整理实训场所的良好职 业素养；养成良好的团队合作 精神。能力训 练任务CMC法测定纤维素酶活力实训教

2、 学 重 点 与 难 点重点难点CMC法测定纤维素酶活力的操作 流程；酶活力的计算方法。葡萄糖标准曲线绘制。各种试液配制；教 学 内任务一纤维素酶的性质纤维素酶的生产流程任务二CMC法测定纤维素酶活力的实验原理CMC法测定纤维素酶活力的操作流程CMC法测定纤维素酶活力的操作要点酶活力的计算教 学 设 计 与 组 织过程设计导入新课通过阐述纤维素酶是一种重要复合酶，主要由外切B-葡聚糖 盟、内切葡聚糖酶和(3-葡萄糖昔酶等组成，还有很高活力的木 聚糖酶活力。纤维素酶反应和一般酶反应不一样,其最主要的区别在于纤 维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶

3、与底物 形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素 上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。酶作用的最适温度为4050C,最适pH在4.06.0.常见的激活剂有：氟化钠、Mg2+、氯化钻、Ca2+、磷酸钙等,纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场 潜力。提出其活力测定的重要性。生产纤维素酶的微生物菌种较多的是有细菌、放线菌、真菌 等，其中酶活力较强的菌种为木霉属(Trichoderma)、曲霉属CAs pergillus)和青霉属(Penic/inm),特别是绿色木霉(Trichoder mavirde)及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维 素

4、酶生产菌。现已制成制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉等纤 维素酶。同时，反刍动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，因此可 以利用瘤胃液获得纤维酶的粗酶制剂。另外，也可利用组织培养 法获得所需要的微生物。纤维素酶的生产流程？时间5min.lOmin5minlOmin种子培羔纤维素酶液体发酵法工艺流程CMC酶活力法测定纤维素酶活力的实验原理纤维素酶水解梭甲基纤维素钠产生还原糖，还原糖能将3, 5- 二硝基水杨酸(DNS)还原，生成橙黄色的氨基化合物，在540nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色 强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤 维素酶的活力。材料与用具材料

5、商品纤维素酶。试剂3, 5-二硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂):称取10 g 3, 5- 二硝基水杨酸，溶于蒸馅水中，加入20 g分析纯NaOH, 200 g酒 石酸钾钠，加水500 ml,升温溶解后，加入重蒸酚2 g,无水亚 硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，冷却，定容至1 000 ml。 贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。0. 1 mol/LpH4. 6醋酸-醋酸钠缓冲液：称取结晶醋酸钠 (CH3C00Na. 3H20)13. 61 g,醋酸(CH3C00H)6. 00 g,用蒸馅水溶 解，并定容至1 000 ml,配好后用pH计校正。lOmin1 mg/ml葡萄糖标准溶液

6、:准确称取100 mg分析纯葡萄糖(预 先在70C、600 mm汞柱下干燥5 h至恒重)，用少量蒸馅水溶解 并定容至100 ml,冰箱中保存备用。底物：0.5%舞甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，配制方为称取 0. 500 0 g手及甲基纤维素钠(Sigma公司生产)，准确至0. 001 g, 用上述缓冲溶液溶解并定容至100 ml,冰箱中保存，有效期3d。待测酶液：称取酶粉1.0 g(或吸取液体酶1.00 ml),先用 少量的0. 05 mol/L pH 4. 5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒 捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加少 量上述缓冲液溶解，如此反复捣研34次

7、，最后全部移入容量瓶 中，用缓冲液定容至刻度，40C水浴锅中浸提1 h,用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。3）器具分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。（五）CMC酶活力法测定纤维素酶活力的操作流程（六）操作要点（1）绘制标准曲线取 Img / ml 葡萄糖液 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0, 1. 2,1.4 ml于7支试管中，再分别加蒸偏水至2.0 ml。向各管加3, 5-30minlOmin5min二硝基水杨酸1.5ml,置沸水浴煮沸5 min,冷却后用蒸馅水定容 至20ml,摇匀。以2ml蒸馅水加DNS溶液1.5ml,按上述同样操 作作为空白

8、调零，在波长540 mm处比色。以吸光度值A为纵坐标, 葡萄糖毫克数为横坐标绘制标准曲线。各管葡萄糖含量见下表。标准曲线绘制各试管所含物质的体积（2）酶样测定管号空白1234567葡萄糖溶00. 20.40.60. 81.1.1.蒸馅水2.01. 81.61.41.21.0.0.DNS/ml1.51.51.51.51.51.1.1.葡萄糖量00.20.40.60.81.1.1.于比色管中加入1. 5 ml 5%竣甲基纤维素钠溶液，在40C水浴 锅中预热5 min,加入0. 5 ml稀释后的酶液，置40C水浴锅中， 立即计时，保温30min（糖化）后取出，即刻加入3 ml DNS显色液, 于沸水

9、浴中煮沸5 min,使酶失活，终止反应，流水冷却，加蒸 馅水5 ml,摇匀，定容至10 ml；同时以0.5 ml缓冲液代替酶 液，同上操作，作为空白，在540nm处比色，测定吸光度值A, 查曲线得相应的葡萄糖含量W。（七）酶活力的计算酶的比活力定义：在pH 4.6, 40C条件下，每分钟水解底物 产生还原糖1网，为1酶活力单位。X= （WXIOOOXn） /（0. 5X180X30）式中，X酶的比活力，U/g；180葡萄糖分子量；0.5酶液的体积，ml；W查标准曲线得出相应的葡萄糖含量，mg；30反应时间，min；n一一酶稀释倍数；1 000由mg换算为ug的换算系数。（A）单元课小结由纤维素酶的性质应用引入，使同学了解学习测定糖化酶 活力的目的、意义。掌握正确的学习方法。安排下节课的学习任务。建立班级学习小组，每4人组成一个学习小组，由班长、 学习委员和小组长组织学习兴趣小组，协助代课老师组 织教学。思考讨论布置思考题。5min.教1.恒温水浴锅。学2.分析天平。仪3.变温电炉。器4.分光光度计。设5.秒表等备教 学 资 料教材：生物产品分析与