生物样品的预处理课件

1、生物样品的预处理2 生物样品的预处理概述不同来源样品分离的预处理细胞的破碎与分离沉淀技术2.1 概述 选材 提取（预处理） 分离纯化浓缩、结晶、干燥 保存来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少将目的物从材料中以溶解状态释放出来，方法与存在部位及状态有关核心操作，须根据目的物的理化及生物学性质及具体条件确定整个过程应有快速灵敏准确的分析方法来衡量效果（回收率、纯度）生化分离基本步骤选材的重要性之案例：青蒿素的提取毒理学和遗传毒理学方法生物群落法生理生化方法监测方法通过测定生物体内污染物的含量，来估测环境污染程度。利用生物群落组成和结构的变化及生态系统功能的变化为指标监测环境污染。通过生物的行为，生

2、长、发育以及生理生化变化为指标来监测环境污染状况。一、生物监测的主要方法有哪些？生物化学成份分析法以污染物引起机体病理状态和死亡为指标监测环境污染状况利用染色体畸变和基因突变为指标监测环境污染物的致突变作用1.生物群落法(生态学方法)利用生物群落组成和结构的变化及生态系统功能的变化为指标监测环境污染。（1）寻找指示生物（2）了解污染物对生物群落的影响例如：蜗虫水蚯蚓一、生物监测的主要方法2.毒理学方法和遗传毒理学方法(1) 通过生物的急性、慢性毒性试验来确 定污染物的毒性。毒理学方法：是以污染物引起机体病理状态和死亡为指标监测环境污染状况。 (2) 为排放物寻找理论上的容许浓度（安全浓度）。3

3、.生理生化法 通过生物的行为，生长、发育以及生理生化变化为指标来监测环境污染状况。遗传毒理学方法：是利用染色体畸变和基因突变为指标监测环境污染物的致突变作用。 微核的变化、Ames试验（1） 细菌学方法（2） 酶的活性（3） 种子发芽率（4） 鱼的呼吸强度（5） 鱼的回避4.生物化学成分分析法（残毒测定法） 通过测定生物体内污染物的含量，来估测环境污染程度。二、国外生物监测动态1. 连续流动比例稀释系统鱼类生物学监测系统监测槽呼吸信号放大器鱼类行为、呼吸信号模拟器计算机稀释系统理化分析监测仪2.人工河流3.光合作用室4.利用激光自动鉴定硅藻种类界面莱塞计算机系统感谢观看，欢迎批评指正中药青蒿的

4、植物来源中华人民共和国药典一九七七年前版均规定为菊科植物黄花蒿（Artemesia annua） 及青蒿（A. apiacea），二者的亲脂性化合物成分存在很大差异，A. annua具抗疟成分青蒿素，而在A. apiacea中则无此成分因而无抗疟作用本草纲目中的附图2.2 不同来源样品分离的预处理样品来源：植物、动物、微生物，例如：植物或动物的细胞培养液、微生物发酵液、动物血液、乳液和动植物组织器官提取液等。生物样品中往往含有大量有机物、无机物及各种微量元素等，因此将目标物释放到溶液中，对其进行初步富集和分离，对干扰组分进行初步去除等工作都属于预处理。生物样品的特征目标产物浓度普遍较低，悬浮液

5、大部分是“水”，组分复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白质、核酸、脂类、糖类、无机盐类等多种物质的混合物；分离过程很容易发生失活现象，pH、离子强度、温度等变化常常造成产物的失活；性质不稳定，易随时间变化，如受空气氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。2.2.1 植物组织中活性物质的提取植物组织中所存在的酚类化合物使植物中提取生物大分子的过程变得复杂。植物组织被破坏时，蛋白质等大分子和酚类处混合接触状态，很易发生反应。酚类氧化产物醌类和单宁酸类会继续和蛋白质反应, 使目的蛋白失去活性。为此去除酚类化合物或避免反应是必须进行的步骤。在提取酶、核酸、多糖等生物大分子时，其他大分子的存在会对提取产生干扰，需

6、要有效手段去除。预处理需要注意温度尽可能低提取液的量要保证“充分浸入”加入足量酚类吸附剂加入足量氧化酶抑制剂搅拌转速要恰当pH要控制在合适范围，一般5.57 酚类吸附剂的种类聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）：PVP和PVPP中的CON基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强聚乙烯和聚丙烯树脂，如离子交换树脂XAD-2、-4和-7聚苯乙烯的离子交换树脂，包括阴离子交换树脂（Bio-Rad AG1-X8,AG2-X8和Dowex-1）和阳离子交换树脂（Dowex-50）Tris-硼酸 硼酸可与酚类靠氢键形成复合物，抑制

7、了酚类物质的氧化及其与生物分子的结合 牛血清白蛋白（BSA）法 原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会 其他聚合物如尼龙粉氧化酶抑制剂的种类抗氧化剂：2-巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)，二硫赤藓糖醇(DTE)，半胱氨酸(Cys)，抗坏血酸盐前三种既是多酚氧化酶的抑制剂又是醌的清除剂抗坏血酸盐在低浓度的醌存在下就很易被消耗，因此须在相对较高的浓度条件下使用（50 mmol/L）硼氢化钠（NaBH4）是还原剂，可以还原醌2.2.2 动物组织预处理注意事项 匀浆前的预处理 (冷冻)提取缓冲液的选择(缓冲物质、pH

8、、离子强度)蛋白酶抑制剂的添加 蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶（如弹性蛋白酶，凝血酶，枯草杆菌蛋白酶，胰蛋白酶等），天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶四个家族，各有对应的抑制剂，如常用的苯甲基磺酰氟（PMSF）是丝氨酸蛋白酶的抑制剂保护剂的添加(-巯基乙醇、EDTA、辅酶等) 提取液的澄清 (高速离心、沉淀、吸附等)2.2.3 微生物物质的提取制备各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。有的发酵产物存在于发酵液中，也有的产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相；对于胞内产物，则应首先收

9、集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。2.2.3.1 微生物发酵液预处理主要包括（1）发酵液杂质的去除（2）改善发酵液的处理性能（1）发酵液杂质的去除发酵液成分复杂，对提取影响较大的是高价无机离子、杂蛋白和色素物质，影响后期离子交换、萃取、膜过滤、测定等无机离子的去除钙离子：加入草酸形成沉淀，酸化发酵液，草酸钙还能促使蛋白质凝固镁离子：加入三聚磷酸钠可与之形成可溶性络合物，可不再干扰离子交换铁离子：加黄血盐使其形成普鲁士蓝沉淀可溶性蛋白质的去除盐析等电点沉淀加热法有机溶剂沉淀法吸附法其它沉淀法有色物质的去除：常用脱色方法为吸附法，如活性炭吸附、树脂吸附等（2）改善

10、发酵液的处理性能细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，往往不能直接过滤，直接用离心法除菌体，则能耗很大，应用微滤的方法，又容易产生膜堵塞。需要通过一些简单手段降低发酵液粘度，改善处理性能。降低发酵液的粘度的方法加热法加水稀释法调节pH值 因pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，通过调节pH值可以改善过滤特性。细胞絮凝技术絮凝指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。通常需控制絮凝剂浓度保持在较窄的范围内,如胶体的颗粒表面吸附大量的高分子物质,反而会在表面形成空间保护层。絮凝剂分类无机絮凝剂 无机盐类絮凝剂(如硫酸铝、硫酸亚

11、铁、氯化铝等) 无机高分子絮凝剂(如聚合氯化铝、聚合铝铁等)有机絮凝剂 天然高分子絮凝剂(如淀粉的改性产物) 人工合成高分子絮凝剂 (如阳离子聚丙烯酰胺)无机与有机复合絮凝剂往往效果更好微生物絮凝剂具较好发展潜力，主要以多糖、多聚氨基酸或糖蛋白为主，还有少量的DNA和脂类絮凝剂絮凝效果与加入量、分子量和类型，溶液的pH值、搅拌速率和时间等因素有关絮凝机理（1）胶体理论 细菌可看做胶粒，因细胞表面的极性基团引起的表面吸附（2）高聚物架桥理论 细胞表面分泌的高聚物形成的胞外纤丝通过架桥交联而使细胞絮凝（3）双电层理论 细胞表面本身有电荷，加入的电解质的排斥作用而促使细胞产生聚并作用2.2.3.2

12、大肠杆菌重组蛋白的提取制备多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白质使整个细胞的蛋白质表达水平提高，但大多情形下会导致诸如包含体的不溶性蛋白聚集的形成重组菌E. coli M15(pQE32-AGN)外源基因的诱导表达(A未诱导，B诱导) 重组蛋白的提取步骤大肠杆菌的酶解 采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁包含体的清洗 用溶剂清洗包含体能进一步除去杂蛋白从包含体中溶解重组蛋白（变性） 选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍），使包含体中重组蛋白溶解重组蛋白的复性 稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等2.3 细胞的破碎与分离细胞的破碎 用一定方法（机械法、物理法、化学法、酶法等）打开细胞壁或膜，使细胞内含物

13、有效地释放出来提取 目的物从胞内转移到外界溶液中。2.3.1 细胞的破碎方法2.3.1.1 机械法 原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞组织捣碎利用高速旋转的叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎（1000020000 r/min）适用：动植物组织DS-1高速组织捣碎机(常用于实验室规模)笼式粉碎机（工业规模）原理图高速匀浆法特点 相对温和，其机械剪切力对生物大分子的破坏较少，处理量大原理 利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂适用 较柔软、易分散的组织细胞高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备由高压泵和匀浆阀组成高压匀浆阀的结构 不同规格的高速匀浆机研磨法与珠磨

14、法研磨法(实验室规模) 由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土）研磨？特点：费时费力，规模小珠磨法(工业规模) 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径1mg/ml（2）吸附法目的物浓度1mg/ml时可用此法（3）膜分离技术超滤属加压膜分离技术之一（4）干胶溶涨法加入具一定孔径微孔能吸水的凝胶，如葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺方式：直接加入或在半透膜外吸收（5）多聚物吸水法PEG、PVP、CMC等具强大吸水力，可在半透膜外吸收（6）减压蒸馏（真空旋转浓缩）2.4 沉淀技术2.4.1 概念和分类概念 溶液中溶质由液相变成固相析出的过程本质 通过改

15、变条件使胶粒发生聚结，降低其在液相中的溶解度，增加了固相中的分配率作用 分离、澄清、浓缩、保存沉淀方法分类盐析有机溶剂沉淀等电点沉淀其他沉淀技术 非离子聚合物沉淀 生成盐复合物 选择性变性 亲和沉淀2.4.2 盐析2.4.2.1 原理“盐溶” 低浓度中性盐离子对蛋白质分子表面极性基团及水活度的影响，增加蛋白质与溶剂相互作用力，使其溶解度增大。“盐析” 中性盐浓度增加至一定值时，水分子定向排列，活度大大减少，蛋白质表面电荷被中和，水膜被破坏，从而聚集沉淀。影响盐析的因素盐离子种类和浓度生物分子种类和浓度pH值温度2.4.2.2 公式和讨论纯蛋白质有盐析经验公式： Log S = kSI S蛋白质

16、溶解度（g/L）； I=0时logS，取决于Pr的性质，温度，pH； kS盐析常数，取决于加入盐的性质及Pr性质； I盐浓度（mol/L）（通常不太用离子强度，高盐浓度下不易计算）I单纯Pr的盐析1kSI的变化（kS盐析）盐、Pr一定，kS值一定，I 增加则S减小 2降低（ 盐析）与Pr、温度、pH有关pH：在Pr的pI时其溶解度较小温度：在保证Pr不变性的条件下，温度升高下降利于盐析在不改变I的情况下改变pH或温度将Pr沉淀3原始浓度PP小则盐析所需I高，P大则盐析所需I低 *对混合Pr的盐析，P大，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为2.53%混合Pr的盐析1合适盐析范围的选择 不同Pr盐析

17、峰有重叠，须权衡纯度和回收率2改变原始浓度 一种蛋白质在不同浓度下的沉淀曲线会变化3二次盐析 在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质二次盐析除去易溶物2.4.2.3 盐析操作要点（1）盐的种类及选择可使用的中性盐有：(NH4)2SO4 Na2SO4 MgSO4 NaCl NaAc Na3PO4 柠檬酸钠 等以(NH4)2SO4 Na2SO4最广泛，前者最受欢迎（原因？缺陷？） 蛋白质沉淀（盐析）效应增加阴离子：PO43, SO42, CH3COO, Cl, Br, NO3, ClO4, I, SCN阳离子：NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+,

18、 Ca2+, Ba2+蛋白质促溶（盐溶）效应增加 （2）盐析范围的确定可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得（从回收率和纯度考虑）（3）盐的加入方式固体：缓慢加，防泡沫，要平衡液体（饱和盐溶液）：要求盐析范围小于50%饱和度 *盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固-液分离确定盐析范围举例试验组别饱和度范围酶沉淀(%)蛋白沉淀(%)纯化倍数ABC04040606080800454570700484865654623226904107515252232213238303525400.162.81.00.0950.192.40.130.293.00.38取

19、小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围（4）Pr的原始浓度太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对Pr回收也有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉（5）盐析操作的其他方法透析盐析 将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使Pr沉淀 特点反抽提法（Back-Extraction） 将包括要分离的Pr在内的多种Pr一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物 特点（6）沉淀的再溶解将沉淀溶于下一步所需的缓冲液（12倍）2.4.2.4 脱盐透析 *容器尽可能大，低温、搅拌、常换液 （旋转透析器、连续循环透析器）凝胶过滤层析 此

20、法脱盐时间短，效果好超滤 膜分离技术根据所加操作压所用膜平均孔径的不同，可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透。利用超滤法把大分子中的小分子除去常用透滤模式。水2.4.3 有机溶剂沉淀2.4.3.1 基本原理 使溶液的介电常数大大降低，从而增加带电粒子自身之间的作用力，易聚集沉淀；介电常数与静电引力的关系，可用库仑公式表示:争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，破坏水化层，使分子易碰聚产生沉淀F=Q1Q2/2 有机溶剂水乙醇丙酮甲醇丙醇尿素（2.5mol/L）介电常数802422332384 相比较，有机溶剂脱水作用较静电作用占更主要的地位 几种溶剂的介电常数2.4.3.2 特点优点：分辨能力比盐析高,即

21、一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行2.4.3.3 沉淀条件温度 生物大分子在有机溶剂中对温度敏感，易变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应有机溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过大温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发温差分级沉淀pH尽可能选择样品溶解度最低的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力要选择在样品稳定的pH范围内，少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性

22、尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生样品浓度 样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降蛋白质0.53，黏多糖12离子强度在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决离子强度达一定程度时(0.10.2 mol/L以上) ，会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，需大量的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出一般离子强度在0.05 mol/L或稍低为好，既能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一

23、定的保护作用，防止变性多价阳离子的影响某些金属离子具有助沉作用，蛋白质与Zn2+、Ca2+等形成复合物，使蛋白质在水和有机溶液中的溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机溶剂的耗量0.0050.02 mol/L的Zn2+可使有机溶剂用量减少l/3至1/2使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根)的存在有机溶剂的选择 常用乙醇、丙酮、甲醇 溶剂用量V= V0（S2S1）/（100S2）分级沉淀 2.4.4 等电点沉淀2.4.4.1 原理等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值，溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀

24、析出，此时溶质的溶解度最低调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术2.4.4.2 注意事项等电点的改变目的物的稳定性盐溶作用pH的调节2.4.4.3 应用在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化等电点沉淀只适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质，如四环素等在等电点(pH=5.4)附近，难溶于水，能产生沉析；疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白） 可以与其他沉淀方法结合使用2.4.5 其他沉淀技术2.4.5.1 非离子多聚物沉淀法沉淀机理 基于体积

25、不相溶性，即聚乙二醇（PEG）类型的分子从溶剂空间中排斥蛋白质，排斥体积与PEG分子大小的平方根有关，与被分离物质无关常用的非离子型聚合物有PEG和PVP，PEG按分子量大小常用的有PEG 2000、PEG 4000以及PEG 6000PEG具有螺旋状的结构，亲水性强，有很广范围的分子量，结构式：HO-(CH2-CH2-O)n-H 低相对分子质量的聚合物无毒，所以在一些临床产品的下游加工过程中被优先选用影响因素 PEG及其他非离子多聚物的沉淀效果除与本身的浓度、分子大小有关外，还受离子强度、pH和温度等因素的影响2.4.5.2 选择性变性沉淀热变性沉淀（适用于对热稳定的物质，注意防止目的物被酶

26、降解）pH变性沉淀（明确目的物酸碱稳定性，注意控制温度）有机溶剂变性沉淀2.4.5.3 生成盐类复合物沉淀金属复合盐法有机酸复合盐法2.4.5.4 亲和沉淀2.4.6 应用实例2.4.6.1 硫酸铵分级盐析分离血清中主要蛋白质材料新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）：100ml离心机、大烧杯（500ml）、烧杯（250ml）高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等pH7.2饱和硫酸铵溶液0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）清蛋白与球蛋白的分离取100ml血浆或血清置于500ml烧杯中，加PBS 100ml搅拌10min在搅拌下慢慢滴加200ml pH7.2饱和硫酸铵溶液加完饱和硫

27、酸铵溶液后继续搅拌2030 min以充分沉淀球蛋白离心（3500r/min） 20min，转移上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白各种球蛋白的分离用100ml PBS溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至250ml烧杯中搅拌15min在搅拌下慢慢滴加25ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达20%离心（3500r/min）20min，沉淀含少量纤维蛋白质，取上清液上清液在搅拌下，慢慢滴加1825ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达3033%离心（3500r/min）20min得上清液（主要含-球蛋白和-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白和少量-球蛋白）取上一步的沉淀溶于PBS中使体积达100ml并转移至250ml烧杯中搅拌15min在搅拌下，慢慢滴加4350ml饱和硫酸铵溶液，约达3033%饱和度离心（3500r/min）20min得上清液（含-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白）取步骤5中上清液在搅拌下，慢慢滴加3540ml饱和硫酸铵溶液，饱和度约达45%离心（3500r/min）20min得上清液（主要为-球蛋白）和沉淀（主要为-球蛋白）2.4.6.2 乙