植物生物技术第一章植物组织培养实验室的构建与无菌操作技术课件

1、第一章 植物组织培养实验室的构建与无菌操作技术第一节、植物组织培养实验室建设第二节、培养基配制第三节、植物组织培养离体操作技术本章主要内容第一章本章教学目的与要求了解植物组织培养实验室的基本设置掌握培养基的选择及配制方法掌握基本的无菌操作技术第一章一、植物组织培养实验室设计二、仪器和设备三、玻璃器皿和用具第一节 植物组织培养室建设第一章一、植物组织培养实验室设计组织培养实验室主要包括：1. 准备室2. 无菌操作室（接种室）3. 培养室4. 温室第一节1、准备室所需器具的清洗、干燥和保存培养基的配制和灭菌生理生化测定等第一节2、无菌操作室（接种室）主要设备：空调、培养架、灯光、除湿机、换气扇等。

2、要求：干爽安静，清洁明亮，墙壁光滑平整不易积污灰尘，地面平坦无缝便于清洗和灭菌。第一节是开展组织培养研究包括接种、继代、细胞融合等的场所。3、培养室是将接种到培养瓶等器皿中的植物材料进行培养的场所。第一节4. 温室 植物组织培养材料移到田间前，通常先移到温室进行练苗，待生根成活后，再移到大田。二、仪器和设备（一）无菌操作设备 、干燥箱：作用：干燥清洗后的器皿 60-80 高温干热灭菌 160-200 测干重时烘干培养材料 80-100 第一节2、高压蒸汽消毒锅类型：手提式高压蒸汽消毒锅 全自动高温高压灭菌锅作用：培养基、水和各种用具的消毒第一节手提式灭菌锅 全自动灭菌锅手提式高压蒸汽消毒锅使用

3、方法：（1）加水：取下锅盖向锅内加3L左右的清水，以接近锅底坐垫为准，注意加水适量，过多容易溅至消毒物上，过少容易烧干。急用时可加入热水。（2）放入待灭菌物品：将消毒物品用灭菌袋包装，放入灭菌锅，不能放得太挤，以免影响空气流通，影响灭菌效果。（3）接通压力表：将锅盖好，注意将盖连接的软管插入铝篮的半圆型槽内，以使篮内感觉到压力与压力表相通。注意锅盖与锅沿之间的橡皮垫扣准，以免漏气，然后旋紧消毒器的螺丝。（4）加热，排放冷空气：接通电源，使其加热，待压力表升至0.5kg时，开放气阀门，放掉原来的空气，直到见到热气。（5）高温高压灭菌：继续加热，使锅内压力达到1.2kg，保持1530分钟。一般情况

4、下超过1.5kg时会自动放气，如达到1.5kg仍不自动放气，则应关电源，使其停止加热。（6）冷却减压：灭菌时间到后关掉电源，使其自然冷却，或间歇放气数次，至完全减压后才可打开锅盖，用完后，将锅内的水倒掉，凉干保管。全自动高压灭菌锅使用方法（参数设置）（1）按“POWER”键打开仪器电源。（2）按“MODE”键选择消毒模式（琼脂、普通液体、固体模式）。（3）按“SET/ENT”键，用“”或“”设置消毒温度；（4）按“NEXT”键，用“”或“”设置消毒时间；（5）按“NEXT”键，用“”或“”设置排气速率；（6）按“NEXT”键，用“”或“”设置保温温度；（7）按“SET/ENT”键保存所设定的参

5、数。使用注意事项（1）使用前必须检查灭菌腔内是否有足够的水。（2）消毒完后必须等压力表指示回零后方可开盖。（3）使用前必须检查手动排气旋钮是否关闭。（4）长期不使用必须将灭菌腔内的水排干。（5）经常检查排气壶内的水是否在安全线内。（6）使用专用电源。3、超净工作台陈列于操作室（接种室）内类型：垂直侧流式和水平层流式工作原理：将室内空气经粗过滤器过滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器过滤，由此送出的洁净气流以均匀的断面风速通过无菌区，形成无菌的工作环境作用：无菌操作第一节4.消毒器Zeiss滤器、玻璃滤器和微孔滤器。Zeiss滤器为不锈钢的金属结构，中间夹有一层石棉制成的一次性纤维滤板。

6、滤板具有一定的厚度，可承受定的压力，因此是过滤粘稠液体较理想的滤器。第一节Zeiss滤器：抽滤式或加压式。抽滤式滤器与抽滤瓶相连，真空泵抽气形成负压以过滤液体；加压式滤器的容器为密闭式，加入待过滤的液体后，通以气体（常用N2、O2或CO2），形成压力将液体滤过。玻璃滤器为玻璃结构，以烧结玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上可用于过滤各种培养液体只能采用抽滤式。微孔滤膜滤器的基本结构与Zeiss滤器相同，其中间是一次性的特制混合纤维素脂滤膜，可用于各种培养液体的过滤除菌，速度较快，效果较好，有孔径为0.6m、0.45m 、0.22m 三种滤膜，用以过滤除菌时，最好使用0.22m 孔径的滤膜（可以除去细菌和

7、霉菌）。25（二）药品贮存、配制相关仪器设备1、冰箱规格：4，-20 ，-80 作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液、激素、酶制剂。超低温冰箱第一节2、天平陈列于制备室中作用：称取大量元素、微 量元素、酶制剂第一节3、酸度计陈列于准备室中作用：测定培养基、酶制剂或缓冲液等的pH值PHS-802中文台式酸度计第一节4. 纯水装置植物组织培养要求使用高纯度的水，进行植物组织培养时，配制各种培养液及试剂等均需使用重蒸馏水，玻璃器皿等的冲洗，也应用蒸馏水自动双重纯水蒸馏器，使用方便、安全、蒸馏速度快。这种蒸馏器的使用方法是将经金属蒸馏器蒸馏的蒸馏水加入玻璃蒸馏器内进行蒸馏。第一节5. 离心机作用：

8、离心洗涤、收集细胞或原生质体、制备细胞悬液、调整细胞密度等低速离心，使用80100g的离心力即可，太大有时可能引起细胞的损伤。因此配置4000rpm的国产台式离心机，离心速度1000rpm即可。第一节（三）培养设备第一节第一节1. 空调作用：控制培养温度2. 加湿器和去湿机作用：控制培养室内湿度状况3. 定时器作用：控制光照时间4. 培养架作用：盛放培养物第一节（四）观察分析仪器设备倒置显微镜 原生质体观察普通显微镜 染色体和叶片气孔观察荧光显微镜 细胞活力观察体视显微镜 形态分化的实体观察激光共聚焦显微镜扫描电镜 病毒检测、细胞器变化透射电镜第一节倒置显微镜主要用于活体的观察比如原生质体培养

9、的过程原生质体融合的动态过程等第一节正置显微镜第一节相差: 一般在显微镜镜头上配置相差环；该方法不要求标本染色，用于观察活体细胞和微生物最为理想。 荧光 ：一般在显微镜镜体上配置荧光滤片，进行荧光蛋白质或荧光染色的观察第一节霍夫曼调制相衬(HMC) 使透明的活体标本产生生动、具有三维立体感的图像。 HMC成像技术中，标本可以置于塑料培养皿中观察。 微分干涉相衬（DIC） 未经染色的活体细胞和微生物所观察到的图像具有三维浮雕状的立体感，且对比度和灵敏度出众。 第一节体视显微镜（解剖镜）第一节立体标本或材料的观察激光共聚焦显微镜Confocal microscopy第一节绿色荧光蛋白标记目的基因在

10、转基因烟草叶片细胞中的表达扫描电镜第一节ABDCEF棉花纤维细胞的突起及伸长观察动植物、微生物细胞内的超微结构，如细胞膜、核膜、线粒体、内质网、高尔基体、核糖体等透射电镜第一节体细胞胚与合子胚超微结构的观察三、玻璃器皿及用具（一）玻璃器皿1.培养器皿培养用的：试管、三角瓶、培养皿等2.分注器类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、 量筒漏斗式分注器3.其他玻璃仪器烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等第一节第一节（二）.器械类1.镊子类型：枪式镊子（接种、转移）、尖头镊子2.剪刀类型：大剪刀、小剪刀、弯头剪刀3.解剖刀类型：固定式和活动式4.接种针用来转移细胞或愈伤组织第一节本节完第二节 培养基配制

11、主要内容：一、培养基的构成二、常用培养基及其特点三、培养基的配制第一章一、培养基的构成（一）水分类型：蒸馏水作用：构成培养基的主要成分第二节（二）无机盐类大量元素：氮(N)、磷（P）、钾（K）、硫（S）、钙(Ca)、镁(Mg)微量元素：铁(Fe)、锰（Mn）、铜（Cu）、锌(Zn)、硼（B）和铝（Al）浓度大于0.5mmol/L的元素为大量元素，小于0.5mmol/L的元素为微量元素作用：提供植物生长所需营养元素 第二节（三）有机营养成分-糖类最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖使用浓度为2%5%作为植物生长发育所需的营养物质调节培养基中的渗透压 第二节（三）有机营养成分-维生素硫胺素（VB1）一般认为

12、是一种必需的成分吡哆醇（VB6），烟酸（VB3），泛酸钙（VB5）和肌醇也都能显著地改善培养的植物组织生长状况第二节（四）植物生长调节剂 1生长素 2细胞分裂素 3 赤霉素类 4. 油菜素内脂 5. 乙烯第二节（四）植物生长调节剂生长素生长素影响到植物茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象在离体植物组织培养中，生长素被用于诱导细胞分裂和根的分化常用的生长素：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）和2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）第二节其中IBA和NAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促进茎的增殖2，4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有

13、效2，4-D+KTIBA+KT第二节（四）植物生长调节剂细胞分裂素细胞分裂素影响植物细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等常用的细胞分裂素有：BAP（苄氨基嘌呤）、6BA（苄基腺膘呤）、2ip（异戊烯氨基嘌呤）、KT（激动素，呋喃氨基嘌呤）和ZT（玉米素）第二节（四）植物生长调节剂赤霉素常用GA3促进茎伸长生长诱导开花促进雄花分化棉花的胚珠培养第二节（四）植物生长调节剂油菜素内脂促进伸长机理与生长素类似第二节（四）植物生长调节剂乙烯解除休眠调节茎伸长生长促进根生长及分化 促进果实成熟第二节（四）植物生长调节剂脱落酸促进休眠 抑制生长 促进气孔关闭 促进脱落第二节（五） 凝固剂琼脂(agar)是固

14、体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。 新型凝固剂：phytagel第二节（六）天然有机添加物质 类型：椰子汁、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥 作用：提供有机营养（七）其他添加物 类型：活性炭、Vc等 作用：防褐化第二节（八）抗生素抗生物质(antibiotic)，包括青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、头孢霉素等，用量在10500mg/L之间添加抗生物质可防止菌类污染，进行选择培养第二节二、培养基的选择（一）培养基的基本类型1. 含盐量较高的培养基：种类：MS培养基 (1962)、LS培养基、

15、BL培养基、ER培养基（1965）等。特点：无机盐浓度高，特别是硝酸根离子、 钾离子和铵离子含量丰富。第二节2. 硝酸钾含量较高的培养基类型：B5培养基（1968）、N6培养基（1974）、SH培养基。特点：培养基的浓度较高，铵态氮含量较低，但硝酸钾和盐酸硫胺素(VB1)含量较高。第二节3. 中等无机盐含量的培养基类型：Nitsch培养基（1969）、Miller 培养基和H培养基。特点：大量元素含量约为MS培养基的一 半，微量元素种类少但含量较 高，维生素种类较多。第二节4. 低无机盐含量培养基类型：White培养基（1983）、WS培养基、HE培养基。特点：无机盐含量非常低，为MS培养基

16、的1/4左右，有机成分也很低。第二节（二）基本培养基的选择培养基：多数植物，但不适合生长缓慢、对无机盐类要求低的植物，尤其是不适合铵盐高会发生毒害的植物。第二节B5培养基：豆类、木本科植物。N6培养基：适合植物的花药培养。White培养基：应用较广，非常适合生根培 养和幼胚培养。WPM培养基：适合木本植物的培养。 特点：氮含量比较低。KM8P: 原生质体培养 注意！ 实际应用中要通过试验筛选。第二节三、培养基的配制（一）培养基母液的配制（以MS为例）1. 基本培养基母液类型：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、维生素母液、肌醇、甘氨酸储存：各种容量试剂瓶 常温或24冰箱倍数：10X、100X

17、、1000等标记：名称、配制倍数、日期等。第二节2. 植物生长调节剂（1000倍）配制方法：2,4D、 NAA 、IAA、IBA、GA3、ZT：先用少量95%酒精溶解后，加水定容。KT、6 -BA：用1mol/L的盐酸溶解后，加水定容。储存：4度或以下长期保存标记：名称、配制倍数、日期等。第二节第二节（二）培养基的配制步骤取一干净烧杯，加入1/3体积的蒸馏水，用移液管量取所需量的母液加入烧杯称取定量琼脂加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装称取定量的糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容用NaOH或稀HCl调节pH值高压灭菌，（121，15 min20min）冷却，取出，备用第二节

18、本节完第三节 植物组织培养离体操作技术一、器皿和用具的清洗二、灭菌与消毒三、无菌操作步骤四、无菌培养第一章一、 器皿和用具的清洗（一）玻璃器皿的清洗（二）塑料器皿的清洗（三）器皿包装第三节二、灭菌与消毒（一） 灭菌和消毒的种类1. 培养基的灭菌2. 器皿和用具的灭菌3. 外植体的消毒4. 接种区灭菌5. 培养环境消毒第三节物理灭菌化学灭菌高温高压灭菌干热灭菌射线照射灭菌过滤灭菌熏蒸灭菌消毒液灭菌（二）. 灭菌方法第三节（三） 灭菌原理1. 高温高压灭菌 原理：将待灭菌的物品放在一个密封的高压高温灭菌锅内，在121高温和每平方厘米1个大气压下，一般持续1530 min，就可杀死一切微生物的营养体

19、及其孢子，适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。 第三节 灭菌需要的时间与物品有关：含有20-50ml培养基的试管或三角瓶，1210C，15含有50-500ml培养基的三角瓶，1210C，15含有500-5000ml培养基的三角瓶，1210C，20空试管、瓶、滤纸等， 1210C，30第三节高温高压灭菌后可能出现的问题(1). pH值下降0.3-0.5 (2). 太高温度灭菌时会使糖焦化,可能产生毒性 (3). 灭菌时间太长会使盐沉淀,同时使琼脂解聚 (4). 挥发性物质不能高温灭菌,否则会被破坏第三节不能高温高压灭菌的物质：多糖Colchicine（秋水仙素）Zeatin（玉米素）GA3（95%

20、失活）VB12、Vc、泛酸Antibiotics（抗生素）Plant extractsEnzymes第三节2. 过滤灭菌法 原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45m微孔滤器装置， 使液、气体通过滤膜流入无孔瓶中。第三节 3. 化学灭菌法主要用于植物材料的消毒，所用浓度、消毒时间因不同材料而定.第三节一些表面消毒剂的使用方法消毒剂 使用浓度 消毒时间（min）次氯酸钙 9-10% 5-30次氯酸钠 2% 3-40过氧化氢 10-12% 5-15溴水 1-2% 2-10硝酸银 1% 3-30氯化汞 0.1-1% 2-15抗生素 4 -500mg/L 30-60第三节对于难消毒的材料,如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等,在消毒前，一般先用肥皂水洗净，自来水冲净再在70%酒精或1N盐酸中浸30再进入消毒剂，消毒剂中可加数滴吐温20，以增强消毒剂的效果第三节三、无菌操作技术(一)、植物材料的消毒接种