植物激素的酶联免疫吸附测定法

1、植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、 放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。由于酶联免疫 吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays,简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方 便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式，一种是在固相载体上包被抗体（直接法）

2、，另一种是包 被抗原（间接法）。直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离 抗体进行竞争。间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。根据质量作用 定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成 的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。材料、试剂及设备1材料各种新鲜植物材料2仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，

3、吸水纸， 恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10p l，40p l,200p l,1000p l）， 带盖瓷盘（内铺湿纱布）。3试剂（1）磷酸盐缓冲液（PBS）:称取 8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 - 12H2O，用量筒 加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。（2）样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。（3）底物缓冲液：称取5.10gCHOHO （柠檬酸），18.43gNa HPO - 12HO，用量筒加1 000ml6 8 72242蒸馏水，再加 1 ml T

4、ween-20， pH 为 5.0。（4）洗涤液：1000ml PBS 加 1mlTween-20。（5）终止液：2mol/L H2SO4。（6）提取液：80%甲醇，内含1 mmol/L BHT（二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解 BHT，再配成80%的浓度）。操作步骤样品中激素的提取（1）称取0.5-1.0g新鲜植物材料（若取样后材料不能马上测定，用液氮速冻半小时后，保存在 -20的冰箱中），加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次 将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4C冰箱中。（2）4C下提取4h, 3500转/min离心8min,取

5、上清液。沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4C下 再提取止，离心，合并上清液并记录体积，残渣弃去。（3）上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是：80%甲醇（1ml）平衡柱一上样一收集样品一移开 样品后用100%甲醇（5ml）洗柱一 100%乙醚（5ml）洗柱一 100%甲醇（5ml）洗柱一循环。（4） 将过柱后的样品转入5ml塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇， 用样品稀释液定容（一般1g鲜重用2ml左右样品稀释液定容，测定不同激素时还要稀释适当的倍数 再加样）。样品测定（本指南所用的量是按一块96孔板计算的）竞争：即加标准物、待测样和抗体。加标样及待测样：取适量所给标样稀

6、释配成：ABA的最大浓度为500ng/ml,IAA, ZR标准曲线 的最大浓度为100ng/ml,GA的最大浓度为10ng/ml，JA-ME的最大浓度为200ng/ml。然后再依次2 倍稀释8个浓度（包括0ng/ml ）。将系列标准样加入96孔酶标板的前两行，每个浓度加2孔，每 孔50p l,其余孔加待测样，每个样品重复两孔，每孔50p l。加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签,如稀释倍数是1： 2000，就要加2.5p l的抗体），混匀后每孔加50p l，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。竞争条件37 C左右0.5h。洗板：将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加

7、入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。共 洗涤四次。加二抗：将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10p l），混匀 后，在酶标板每孔加100p l，然后将其放入湿盒内，置37C下，温育0.5h。洗板：方法同竞争之后的洗板。加底物显色：称取10-20mg邻苯二胺（OPD）溶于10ml底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完全 溶解后加4p l 30% H202。混匀，在每孔中加100p l，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出 标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50p l 2mol/L硫酸终止反应。比色：在酶联免疫分光光度计

8、上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。结果计算：用于ELISA结果计算最方便的是logit曲线。曲线的横坐标用激素标样各浓度（ng/ml ）的自 然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下：Logit （B/B ） =ln0 =ln01-B/B B -B其中B0是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度的显色值。待测样品可根据其显色值的logit值从图上查出其所含激素浓度（ng/ml）的自然对数，再经过 反对数即可知其激素的浓度（ng/ml）。求得样品中激素的浓度后，再计算样品中激素的含量（ng/g fw）。湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）生产商朗盛产地德国产品名称2, 6一二叔丁基对甲苯酚化学结构式分子式C15H24O分子量 220.4g/mol外观白色无嗅结晶粉末质量指标熔点68 70C沸点257-265闪点127C溶解点g/100g 溶剂甲醇16乙醇22.8苯63.9异丙醇20.9甲乙酮67.1水、稀碱液不溶应用一油墨，涂料，胶粘剂， 聚胺酯，矿物油，石油化工等产品中一食品用橡胶，塑料产品一食品，饲料，医药中包装25千克/ 袋储存干燥，阴凉，温度低于50C以下，保存2年10ug