飞蝗细胞色素P450基因的分子特性及功能研究(共9页)

1、飞蝗细胞色素P450基因的分子(fnz)特性及功能研究【摘要】：细胞色素P450基因是最庞大的超基因家族之一,存在于几乎所有的生物体内。在昆虫体内,细胞色素P450作为一种重要的代谢酶系,可以代谢多种杀虫剂及植物次生代谢物质。细胞色素P450功能的多样性是由其基因的多样性决定的。目前已有超过1000个昆虫细胞色素P450基因被识别和鉴定,数目还在不断增加。飞蝗是我国重要的农业害虫,对其生理生化、发育生物学、免疫学及有效控制等方面的研究具有重要意义。本文对飞蝗细胞色素P450基因进行了系统研究,从分子水平揭示飞蝗不同家族细胞色素P450基因的组织、发育阶段及杀虫剂诱导表达特性,通过RNA干扰技术

2、研究飞蝗细胞色素P450基因对杀虫剂的代谢解毒机制,主要研究结果如下：1、飞蝗细胞色素P450基因的搜索及其分子特性研究采用生物信息学方法(fngf),根据昆虫细胞色素P450的保守区(motif),对飞蝗EST数据库进行了全面搜索,并对获得的细胞色素P450的ESTs进行了拼接和注释。获得15个细胞色素P450基因片段,分别命名为LmP450-1-15。采用RT-PCR检测了15个细胞色素P450基因在五龄飞蝗不同组织部位和发育阶段的表达,结果发现大多数细胞色素P450基因主要在中肠、胃盲囊和脂肪体表达,少部分主要在马氏管和后肠表达,极少数在前肠有明显表达；飞蝗细胞色素P450基因在三、四龄

3、表达较高,而在卵这一阶段相对表达较少。采用三种杀虫剂(溴氰菊酯、马拉硫磷和西维因)对三龄飞蝗进行了剂量和时间依赖效应实验,结果表明：三种杀虫剂在不同浓度处理条件下,只有(zhyu)在溴氰菊酯浓度为LD10和LD30分别引起细胞色素P450酶活性升高1.33倍和1.70倍,而用马拉硫磷和西维因处理虫体后,细胞色素P450酶活性没有明显的变化。溴氰菊酯处理三龄飞蝗12h,酶活性最高。进一步研究点滴溴氰菊酯不同时间,细胞色素P450基因表达量的变化,结果表明：大多数基因在溴氰菊酯处理12h表达量最高,表明细胞色素P450酶活性的增高是由于基因表达量增加的结果。2、飞蝗细胞色素P450基因全长序列克隆

4、通过RACE-PCR方法,对15个飞蝗细胞色素P450基因片段进行5和3-RACE扩增,获得2个细胞色素P450基因全长序列,由细胞色素P450国际命名委员会分别命名为CYP409A1和CYP408B1,并确定为两个新家族基因。采用生物信息学方法对飞蝗的转录组数据库进行了全面搜索,并对获得的细胞色素P450基因序列进行克隆,共获得6个细胞色素P450基因全长序列,由细胞色素P450国际命名委员会分别命名为CYP6FD1、CYP6FD2、CYP6FE1、CYP6FF1、CYP6FG1和CYP9AQ2.将8个飞蝗细胞色素P450氨基酸序列与果蝇的细胞色素P450s进行聚类,结果显示,除CYP409

5、A1和CYP408B1两个新家族成员外,其它各家族基因均与果蝇的同一家族成员聚为一簇。8个飞蝗细胞色素P450基因均属于CYP3族(Clan)的成员,该族成员与药物及外源物质的代谢相关。3、飞蝗细胞色素P450基因的发育阶段及组织特异表达采用Real-timePCR技术检测了8个飞蝗细胞色素P450基因在不同发育阶段的表达,发现CYP409A1、CYP6FG1和CYP9AQ2三个基因在卵阶段mRNA的表达与其它发育阶段相比表达量较低。而CYP6FD1、CYP6FD2和CYP6FE1在卵阶段几乎没有表达,CYP6FD1在四龄表达最高,一龄到三龄次之；CYP6FD2表达较为特殊,仅在成虫期高表达；

6、CYP6FE1在四龄表达量最高,五龄和成虫次之。CYP408B1和CYP6FF1在飞蝗各个发育阶段均有表达。采用Real-timePCR技术检测了8个飞蝗细胞色素P450基因在飞蝗五龄若虫不同组织部位的表达,结果显示：CYP409A1在所有组织中都有表达,但表达强弱有所不同,马氏管表达量最高,胃盲囊和脂肪体表达量次之,血淋巴和肌肉中表达量最低。CYP408B1在前肠高表达,后肠、脂肪体、肌肉和脑中也有一定的表达。除血淋巴外,CYP9AQ2在其余组织部位均有较高的表达,前肠表达量最高。CYP6家族的5个基因在脂肪体或马氏管表达量最高。4、溴氰菊酯对飞蝗细胞色素P450基因的诱导表达采用Real-

7、timePCR对不同浓度溴氰菊酯处理飞蝗后细胞色素P450基因的表达进行了分析。结果表明：CYP409ALCYP6FD2,CYP6FF1和CYP6FG1均表现为低剂量诱导的趋势,与对照相比,在溴氰菊酯LD10剂量下,其mRNA表达量提高了1.7-2.0倍。CYP9AQ2在溴氰菊酯三个剂量作用下都有高表达,为对照的2.26-2.55倍。CYP408B1和CYP6FE1的表达情况在溴氰菊酯处理前后没有显著的变化。只有CYP6FD1基因mRNA的表达受到抑制,且呈现剂量依赖趋势,随着浓度的增加mRNA表达量逐渐下降。采用溴氰菊酯处理飞蝗4、8、12、24和48h,除CYP408B1和CYP6FD1外

8、,大多数细胞色素P450基因在溴氰菊酯处理后表现出不同程度的诱导作用,在溴氰菊酯处理飞蝗12h其诱导表达量与同一时间点对照相比可达1.2-6.7倍。CYP408B1和CYP6FD1经溴氰菊酯处理不同时间后其mRNA表达呈现被抑制的现象,前者在48h表达量最低,后者在8h表现出最低的表达量。5、基于RNAi的飞蝗细胞色素P450基因功能研究本研究发现在分别注射CYP409A1、CYP408B1、CYP6FF1和CYP9AQ2等4个细胞色素P450基因dsRNA后点滴溴氰菊酯,与注射dsGFP后点滴溴氰菊酯相比,飞蝗的死亡率明显提高,表明这4个基因在飞蝗对溴氰菊酯的代谢中起着关键作用。分别注射CY

9、P6FD2和CYP6FE1基因dsRNA后点滴西维因,与注射dsGFP的对照相比,飞蝗的死亡率明显提高,表明CYP6FD2和CYP6FE1基因可能参与飞蝗对西维因的代谢。分别注射8个细胞色素P450基因特异dsRNA后点滴马拉硫磷或DDT,与注射dsGFP的对照相比,飞蝗的死亡率均未见显著性差异,表明本研究中获得的8个细胞色素P450全长基因可能并不涉及马拉硫磷或DDT的代谢。6、飞蝗细胞色素P450基因的原核表达本研究试图以CYP409A1和CYP408B1为例,建立飞蝗细胞色素P450基因大肠杆菌表达系统。结果表明：我们成功构建了pET28a-CYP409A1和pET28a-CYP408B

10、1两种重组蛋白。但遗憾的是对两种重组蛋白在大肠杆菌宿主细胞中未获表达。综上所述,本研究基于飞蝗EST数据库平台获得15个细胞色素P450基因片段,并进行了初步的分子特性研究,为进一步研究飞蝗细胞色素P450提供了新的资料；通过克隆获得8个飞蝗细胞色素P450基因全长序列,为深入研究飞蝗细胞色素P450基因结构与功能奠定了基础；采用Real-timePCR技术系统分析了8个细胞色素P450基因在飞蝗不同发育阶段、不同组织部位及溴氰菊酯诱导下的表达特性,并基于RNAi探讨了飞蝗细胞色素P450基因与杀虫剂代谢的关系；另外,还初步进行了飞蝗细胞色素P450基因的大肠杆菌表达研究。研究结果将为进一步开

11、展飞蝗细胞色素P450的生物学功能和生理生化特性提供了资料,对于探讨飞蝗体内细胞色素P450对杀虫剂的代谢解毒机理具有重要的意义,为基于细胞色素P450基因研究的蝗虫有效控制提供科学依据,同时也为丰富细胞色素P450的整体研究体系作出一定贡献。【关键词】：飞蝗细胞色素P450表达序列标签杀虫剂RNA干扰【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q963【目录】：中文摘要13-16ABSTRACT16-21第一章前言21-431.1细胞色素P450与细胞色素P450酶系21-241.1.1细胞色素P450211.1.2细胞色素P450酶系21-221.1.

12、3细胞色素P450的命名22-231.1.4细胞色素P450的结构特征23-241.2昆虫细胞色素P450的多样性及其进化24-271.2.1种类的多样性24-261.2.2分布的多样性261.2.3催化反应的多样性261.2.4细胞色素P450的进化26-271.3昆虫细胞色素P450基因的功能27-341.3.1内源物质的代谢28-301.3.2外源物质的代谢30-341.4昆虫细胞色素P450基因的表达与诱导34-351.4.1昆虫细胞色素P450基因的表达特性341.4.2昆虫细胞色素P450的诱导34-351.5昆虫细胞色素P450的研究方法35-401.5.1昆虫细胞色素P450基

13、因的克隆策略35-381.5.2昆虫细胞色素P450的异源表达系统38-401.6飞蝗概述40-421.6.1飞蝗的分布与为害401.6.2飞蝗的研究进展40-421.7本研究的立题依据及主要研究内容42-43第二章飞蝗细胞色素P450基因EST序列的获得及其特性分析43-592.1研究材料43-452.1.1供试昆虫43-442.1.2主要试剂442.1.3主要仪器44-452.2研究方法45-502.2.1飞蝗EST数据库中细胞色素P450基因的搜索452.2.2飞蝗细胞色素P450基因PCR引物设计452.2.3RT-PCR分析细胞色素P450基因的表达特性45-482.2.4杀虫剂对飞

14、蝗细胞色素P450的影响48-502.3结果与分析50-562.3.1飞蝗细胞色素P450基因片段的获得50-522.3.2基于RT-PCR的细胞色素P450基因的表达特性分析52-532.3.3杀虫剂对飞蝗细胞色素P450的影响53-562.4讨论56-59第三章飞蝗细胞色素P450基因克隆59-823.1研究材料59-603.1.1供试昆虫593.1.2主要试剂59-603.1.3主要仪器603.2研究方法60-673.2.1飞蝗细胞色素P450基因cDNA全长的获得60-653.2.2飞蝗细胞色素P450基因全长cDNA的验证65-673.2.3飞蝗细胞色素P450基因序列分析673.2

15、.4飞蝗细胞色素P450的聚类分析673.3结果与分析67-803.3.1飞蝗细胞色素P450基因全长cDNA的获得及命名67-683.3.2飞蝗细胞色素P450基因cDNA序列的生物信息学分析68-793.3.3飞蝗细胞色素P450的聚类分析79-803.4讨论80-82第四章飞蝗细胞色素P450基因的发育和组织表达特异性82-904.1研究材料82-834.1.1供试昆虫824.1.2主要试剂824.1.3主要仪器82-834.2研究方法83-854.2.1飞蝗细胞色素P450基因Real-timePCR引物设计834.2.2飞蝗细胞色素P450基因在不同发育阶段的表达83-844.2.3

16、飞蝗细胞色素P450基因在不同组织部位的表达84-854.3结果与分析85-884.3.1飞蝗细胞色素P450基因不同发育阶段的表达分析854.3.2飞蝗细胞色素P450基因不同组织部位的表达分析85-884.4讨论88-90第五章溴氰菊酯对飞蝗细胞色素P450基因的诱导表达90-975.1研究材料905.1.1供试昆虫905.1.2主要试剂905.1.3主要仪器905.2研究方法90-925.2.1实验材料的准备90-915.2.2总RNA的提取、纯化及cDNA第一链的合成915.2.3Real-timePCR分析溴氰菊酯对飞蝗细胞色素P450基因表达的影响915.2.4数据分析91-925

17、.3结果与分析92-955.3.1不同浓度溴氰菊酯对飞蝗细胞色素P450基因的诱导表达925.3.2溴氰菊酯处理飞蝗不同时间后细胞色素P450基因的诱导表达92-955.4讨论95-97第六章飞蝗细胞色素P450基因的解毒功能分析97-1066.1研究材料97-986.1.1供试昆虫976.1.2主要试剂97-986.1.3主要仪器986.2研究方法98-1016.2.1飞蝗细胞色素P450基因dsRNA引物设计及体外合成98-1006.2.2飞蝗细胞色素P450基因沉默效率及交叉干扰检测1006.2.3细胞色素P450基因沉默后飞蝗对杀虫剂的敏感性分析100-1016.3结果与分析101-1

18、046.3.1飞蝗细胞色素P450基因沉默效率及交叉干扰分析101-1026.3.2细胞色素P450基因沉默后飞蝗对杀虫剂的敏感性分析102-1046.4讨论104-106第七章飞蝗细胞色素P450基因的原核表达106-1147.1研究材料106-1077.1.1供试昆虫1067.1.2主要试剂106-1077.1.3主要仪器1077.2研究方法107-1107.2.1飞蝗CYP409A1和CYP408B1蛋白表达引物设计1077.2.2PCR扩增及产物检测107-1087.2.3PCR扩增产物的回收纯化1087.2.4双酶切及连接反应108-1097.2.5转化109-1107.2.6重组质粒的表达1107.2.7重组蛋白的诱导表达1107.2.8表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)检测1107.3结果与分析110-1127.3.1飞蝗CYP409A1和CYP408B1蛋白全长表达验证110-1117.3.2飞蝗CYP409A1和CYP408B1基因重组表达载体的检测1117.3.3SDS分析CYP409A1和CYP408B1在大肠