山楂果实中主要活性物质研究

1、山楂果实中主要活性物质研究摘要：对山楂果主要活性物质的研究，首先，进行了山楂果总的液相色谱鉴定、黄酮类提取分离及生理活性探究，继而，对黄酮类代表原花青素，和三萜类代表熊果酸的化学结构、提取分离、结构鉴定（红外、紫外、质谱、核磁共振）、生理活性展开论述。关键词：山楂、原花青素、熊果酸山楂属植物为蔷薇科，分布于北温带，世界有该属植物1000余种。山楂品种复杂，中国植物志载：本属植物我国有17种，中国药典（2000年版规定中药山楂原植物为北山楂（Crataeguspinnatifida和山里红（C.pinnatifidaVarMajor的果实。近年来，国内外学者对其原植物、化学、炮制、理及临床研究都

2、有较大发展。山楂在我国是一种重要的化滞中药，经本草考证山楂之名始载于本草纲目，在此之前以“赤爪草之名始载新修本草，历来为药食两用之佳。近几十年来，更广泛用于治疗心血管疾病。【1】1、山楂的研究11山楂的化学成分山楂的主要成分是黄酮类物质，对心血管系统有明显的药理作用。目前，从山楂中分离的黄酮成分有30余种，主要有含碳键的黄酮苷类、黄酮醇及其苷类、双氧黄酮苷类、聚合黄酮类。另一类较为重要的成分是三菇类物质，有强心、增加冠脉血流、改善血流循环等重要作用。此外，山楂中含有机酸如氯原酸、咖啡酸及鞣质、鞣酐、表儿茶酚、胆碱、乙酰胆碱、B谷笛醇、胡萝卜素等。其他成分有蛋白质、糖类、维生素类等。其中，黄酮类

3、代表，以儿茶素、表儿茶素为单元的原花青素类（pROcyanidins,简称PC）,其在标准化提取物中含量达20%左右；以及，三菇类代表，熊果酸。（本文主要介绍）总黄酮提取分离方法A.提取方法：永煎煮提取：山楂果肉30g,用蒸攘水蘸煮2次，滤过，浓缩,褥山楂浸膏。乙醇回流提取：取山楂果肉30g,以60%乙醇阐流提取2次，每次1。5h。合并提取液，圈收乙醇，褥出棱浸膏。甲醇为溶剂，索氏提取：取山横果肉30g,戳荤醇为溶剂，用索氏提取器匿流提取4h,隧收甲醇，得山榱浸膏。超声提取：取山楂果肉30g,加60%乙醇，超声3次，每次45min，合并提取液，回收乙醇，得山楂浸膏。b.大孔吸收树脂分离提取总黄

4、酮：将所得山楂浸膏分别加入适量蒸憎水，搅匀，加入CaC12lg,静置过夜。离心，分别收集上清液，用氨水调pH至78,分别加入大孔吸附树脂柱中，调节流速5mL/min,用蒸憎水洗去杂质，以乙醇为流动相解吸附，回收乙醇，得总黄酮提取物。将水提取物稀释成含生药1g/10mL的溶液，其他提取物稀释成含生药1g/200mL的溶液，分别测定总黄酮含量。山楂的结构鉴定山楂果实中活性成分分析的HPLC谱图%、(Hrwx1未知前花青素二聚体；2未知前花青素三聚体；3未知前花青素四聚体；4绿原酸；5.前花青素B2；6.异绿原酸；7.未知酚酸；8.前花青素C.；9,表儿茶素；10.未知成分；11.未知成分；12.前

5、花青素Bs；13.金丝桃14.Isoquereitrin.生理活性心血管作用a.降血脂作用：学者对山楂黄酮调节脂质代谢作用进行了大量研究(冯凤莲等，1997),研究表明山楂及山楂黄酮能显著降低血清和肝脏丙二醛(MDA)含量,增强红细胞和肝脏超氧化物歧化酶(SOD)的活性。同时增强全血谷胱甘肽还原酶(GSH.Px)活性。还能显著抑制喂高脂高胆固醇饲料大鼠的血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白一胆固醇(LDL-C)和ApoB浓度，显著升高高密度脂蛋白.胆固醇(HDL-C)和ApoAl浓度，但对甘油三酯(TG)影响不大。b.降压作用：山楂黄酮、三萜酸及水解物静注、腹腔注射、十二指肠给药，对麻醉猫的血压

6、均显示不同程度的降压效应。山楂三萜酸在20.40medkg范围以25mg/kg静注降压作用最强，再加大剂量其降压效应亦不相应增加。山楂黄酮、三萜酸水解物以同等剂量(25mg/kg)静注比较，以三萜酸降压效应最明显；但产生显著降压作用之剂量以黄酮为最低(沈映君，2000)。c.舒张血管作用：山楂总黄酮可增加冠脉流量，抗实验性心肌缺氧，抗心率失常等作用，山楂提取液无论体内或体外给药均可显著抑制家兔血小板凝集性，这对冠心病等心血管疾病的防治显然是有益的(SchusslerM.，1995)。对消化系统的作用山楂提取物有增加胃液分泌的作用，还能增加胃中酶类，所含脂肪酶可促进脂肪分解，山楂酸等可提高蛋白质

7、分解酶的活性，有助消化作用(尹卫靖,1996)。对中枢神经系统的作用山楂能显著延长小鼠睡眠持续时间。小鼠腹腔注射山楂2.59/kg(按生药计)20min后，给予戊巴比妥钠，观察小鼠睡眠持续时间。结果发现对照组31.820.1rain，山楂组88.338.9min。用药组和对照组比较(POH原花青素结构通式2.2提取分离方法原花青素的提取一般采用溶剂提取法。提取溶剂一般采用甲醇、丙酮等有机溶剂。进行分离、纯化时，也多采用有机溶剂，如乙醚、石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷等。分离包括溶剂萃取、膜过滤或超滤、反渗透及色谱法。溶剂萃取一般采用乙酸乙酯，乙酸乙酯属中等极性溶剂，可以选择性地萃取原花青素低聚体(

8、DPI.7),用于粗提物的初步纯化，萃取后用氯仿或石油醚沉淀其中的原花青素，或进一步用柱色谱提纯。美国专利中对超滤及反渗透的应用也比较多，如用超滤膜除去相对分子量5000的杂质及高分子量的原花青素，再用反渗透除去小分子杂质，结合柱色谱分离，可以得到纯度较高的原花青素(USPatent5912363)。2.3结构鉴定方法2.3.1山楂果肉原花青素紫外可见光谱参考文献(Kennedyetal.,2001)中原花青素的结构通式可知，原花青素结构单元中含有苯环，且苯环上有OH取代基，使苯环的B带(255nm)显著红移，使原花青素在280nm附近有特征吸收峰。2.3.2山楂果肉原花青素红外光谱下图为葡萄

9、籽原花青素标品的瓜光谱图3300cm-1左右的吸收峰为原花青素分子中羟基的伸缩振动；2360cm-1左右，1600cm-1左右，1500cm-1左右，1400cm-i左右是苯环的骨架振动特征吸收；指纹区800-650cm-1出现较强的吸收峰，表明苯环上有邻对位多取代基；1270cm-1左右和llOOcm-1左右吸收峰为C环中的C-O-C伸缩振动。2.3.3原花青素的ESIMS分析将100ug/mL的CSPCs直接进样，进行ESIMS分析，得到经大孔树脂纯化后CSPCs的分子量范围为289.41154.9，对应的m/z(质荷比)峰分别为577.2、289.4、865.2、1154.9。生理活性原

10、花青素具有很强的抗氧化性。原花青素是多酚类物质，具有高度羟基化的结构，能够起到抗氧化、清除自由基、抑菌等作用，有很好的开发利用价值。主要作用1、清除自由基、抗氧化；2、酶抑制、保护心血管及美容、抗衰老作用；3、抗癌活性。是一种强有力的自由基捕获剂，它可以清除体内过多的自由基，恢复代谢平衡，对一系列由自由基造成的损伤引起的疾病，如某些炎症、心血管疾病、血循环障碍、关节炎、循环疾病、神经疾病和许多与衰老有关的疾病等均具有预防和改善作用。原花青素体内吸收快，能通过血脑屏障，可对自由基所导致的脑和脊髓神经的损伤起保护作用，避免因此而引发的帕金森氏综合症、早老性痴呆症等。3、熊果酸的研究概述【4】化学结

11、构53.提取分离方法经溶剂提取后，提取液中含有目标组分和杂质，为获得目标组分，须对提取液中目标组分和杂质进行剥离，从而获得高纯度目标化合物。在目标组分和杂质的剥离过程中，考虑目标组分和杂质的物理化学性质差异，采用特定的分离纯化方法，进行目标组分的精制。中草药中主要的分离纯化方法有有机溶剂萃取法、双水相萃取法、沉淀法、柱层析法、结晶法、膜分离法等。结构鉴定3.3.1红外光谱取1mg样品与溴化钾约130mg起研磨压片，在红外分光光度计波数4000400cnw叫范围内扫描，得下图。3.3.2电子轰击离子源-质谱联用法EIMS(m/z)423(M-CH-HOn411(M-CQQH).456(M+)、4

12、41(M-CH)、438(M-H0)32410(M-HCQQH)(图省略)3.3.31H和13CNMR光1HNMR显示5个季碳甲基(80.65、0.70、0.81、0.86、0.98,各3H),TOC o 1-5 h z单峰；2个叔碳甲基(80.74、0.83,各3H),双峰；C、C-H(82.05)，双1819峰；C-H(83.08)；单峰；C-H(85.11,1H,brs),单峰；C-H(82.05,312181H,85=11Hz)、C-H(80.83,3H,d,J=6Hz)，双峰；C-H(80.74,3H,d,J=6Hz)o13CNMR示7个伯碳：815.65(C)、15.86(C)、2

13、7.16(C)、24252621.18.37.34(C)、23.3067(C)、24.610(C)、392224(C)、551879(C)、23.61(C)、28.302756(C)、27.06(C)、28.16204(C)；7个叔碳：839.169(C)、79.08(C)、1255326(C)；9个仲碳：82336(C)、31.01(C)52108(C)、39.47(C)201979(C)；6个季碳：81217.33.47.7.24(C)、1142(C)、795(C)、928(C)、1029303931(C)、3983(C)、4242(C)、4816(C)、13850(C)(图省略)4814

14、17133.3.4反相高效液相色谱色谱条件：WatersSymmetryTMC色谱柱(250mmx4.6mm,5um)；流动相为18甲醇-水(90：10,体积比)，磷酸调pH值3.0,0.45um微孔滤膜滤过，临用前TOC o 1-5 h z脱气处理；进样量10uL；检测波长2103nm；柱温为室温；流速1.0mL/min；检测灵敏度为1.0。.分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8/.02468101214和1.0mL熊果酸标准储备液(1g/L)至10mL容量瓶中，褸甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件进样测定，以峰高为纵坐标，样品浓度为横坐标作图得回归方程为Y=1.34+15.762X，r=0.

15、9997，说明熊果酸在1.911.68mg/L范围内，峰高与样品质量浓度呈良好线性关系。3.5生理活性熊果酸具有镇静、抗炎、增强机体免疫力、抗菌、美白、抗癌等药理作用，近年更被中国医学科学院肿瘤医院实验证明其有望成为低毒、有效的新型天然抗癌药物，因而具有很强的研究开发价值。3.5.1镇静熊果酸有明显的安定和降温作用，能降低大鼠的正常体温，减少小鼠自发活动，并能增强戊巴比妥的催眠作用和抗戊四唑的抗惊厥作用.3.5.2抗炎、抗菌熊果酸尚有抗炎，增强肝糖元，降低心肌、横纹肌肌糖元及糖皮质激素作用，动物实验表明，熊果酸1000mg/kg有降低血清转氨酶的作用。熊果酸在体外对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和

16、酵母菌有抑制作用，对培养的肝癌细胞有明显的抑制作用，并能延长荷艾腹水癌小鼠的生命。3.5.3增强机体免疫力熊果酸在体外能快速杀死培养细胞，使培养淋巴细胞几乎完全失去淋转、白细胞介素一2生成、LAI【细胞产生能力，但是腹腔注射熊果酸的小鼠上述三种指标均明显提高3.5.4抗肿瘤作用a.抗突变作用：熊果酸能对抗致癌物质如苯并芘、黄曲霉素B1诱发的基因突变；b抗诱变和抗促癌作用：熊果酸能使诱变剂所致的多染色质的微核红细胞数减少76%。熊果酸可以抑制佛波酯(TPA)的促癌作用，对TPA诱导Raji细胞EPsteinBar病毒早期抗体(EBv一FA)活化具有几乎同维甲酸相同的抑制作用，并使Raji细胞的存活率较微甲酸处理组更高；抗氧化作用：熊果酸可能通过抗氧化作用起到抗始发突变与抗促癌作用。熊果酸是一个较强的抗氧化剂，能明显地捕获氧自由基；细胞毒作用：Lee等用熊果酸进行了6种癌细胞系的细胞毒性试验，结果表明熊果酸对P-388和L-1210白血病细胞、A-549人肺腺癌细胞有显著的细胞毒作用，其LD50均小于4mg/ml:抗血管生成作用：血管再生是实体瘤的增长和转移